[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010243529.8
• 申請日: 2010-08-03
• 公開（公告）號: CN101906477A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白俊杰;馬冬梅;姜鵬;陳敏;樊佳佳;葉星;李勝杰;于凌云;全迎春
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所 44229
• 代理人: 陳雅平

1.轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法，其特征是：

（一）引物的設(shè)計

根據(jù)紅色熒光蛋白基因序列設(shè)計并合成引物如下：

P1：5'-GTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGT-3'

P2：5'-CTACAGGAACAGGTGGTGGCGG-3'

以轉(zhuǎn)紅色熒光蛋白基因唐魚基因組DNA為模板預(yù)期擴(kuò)增片段487bp，以野生唐魚基因組DNA為模板預(yù)期無擴(kuò)增片段出現(xiàn)；

（二）模板DNA的提取

（1）取待檢測的整個唐魚魚苗或唐魚的肌肉組織剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10?mmol/L?Tris-HCl；0.1?mol/L?EDTA；0.5%?SDS；30mg/L?RNase；100mg/L?蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小時，其間不時輕輕搖動；

（2）加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，室溫下靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液，再用氯仿抽提一次，室溫下靜置5分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清液；

（3）加入2倍體積的無水乙醇，室溫靜置10分鐘沉淀DNA，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；

（4）用70%乙醇洗滌1次，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸去上清，室溫靜置干燥10分鐘，加入50μl?TE（10mmol/L?Tris－HCl；1mmol/L?EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

（三）PCR反應(yīng)體系

ddH₂O??????????????????????????????????20μL

10×PCR?Buffer?????????????????????2.5μL

4×dNTP（10mmol/L）????????0.5μL

Taq酶（5U/μL）?????????????????0.2μL

P1?（10μmol/L）????????????????0.4μL

P2?（10μmol/L）????????????????0.4μL

模板DNA????????????????????????????1.0μL

（四）PCR反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒，64℃退火30秒，72℃延伸30秒，32個循環(huán)；72℃延伸7分鐘；

（五）瓊脂糖凝膠電泳檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠（含熒光染料）中電泳，電壓5V/cM，電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察并照相。