[發(fā)明專(zhuān)利]一種多重分型的斑馬魚(yú)遺傳質(zhì)量檢測(cè)試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010242142.0
• 申請(qǐng)日: 2010-08-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102344955A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡建華;趙瑩;濮俊毅;沈志敏;劉雄偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 上海專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及斑馬魚(yú)遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別是一種針對(duì)4個(gè)斑馬魚(yú)常用品系挑選12個(gè)SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)12對(duì)引物和特異探針，利用SNP位點(diǎn)引物PCR結(jié)合連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase?detection?reaction，LDR)檢測(cè)斑馬魚(yú)遺傳質(zhì)量的多重分型方案試劑盒。

背景技術(shù)

目前，斑馬魚(yú)對(duì)發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、毒理與環(huán)保等方面的研究極其重要。目前國(guó)內(nèi)斑馬魚(yú)除了微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)的質(zhì)量情況，還存在遺傳質(zhì)量上的軟肋。國(guó)際上早已形成較為成熟的幾個(gè)斑馬魚(yú)品系，并以此為探索新的育種。國(guó)內(nèi)很多單位在斑馬魚(yú)的引種和保育方面不但存在盲目引種，還有飼養(yǎng)管理不善引起的種質(zhì)退化和混種等情況。遺傳質(zhì)量也是構(gòu)成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要方面，而水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也不適宜采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物通用的生化或組織學(xué)遺傳鑒定方法。此外，因?yàn)檫z傳學(xué)檢測(cè)可以與微生物學(xué)檢測(cè)共享核酸樣品，所以無(wú)疑能夠事半功倍。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)可以應(yīng)用于水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制與檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)或推薦方法，對(duì)于國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)用魚(yú)質(zhì)量的現(xiàn)狀也缺乏系統(tǒng)的調(diào)查和一手資料。我們擬引入國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)株，采用分子遺傳學(xué)方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析，來(lái)檢測(cè)國(guó)內(nèi)斑馬魚(yú)的遺傳質(zhì)量。

DNA分子作為遺傳信息的直接載體，不受環(huán)境、生物發(fā)育階段及器官組織的影響，因而能較為準(zhǔn)確地反映出各個(gè)物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，但常規(guī)的PCR方法針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)需要一個(gè)PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增。為了節(jié)省樣本、減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間、本研究采用多重PCR，即通過(guò)將多對(duì)引物設(shè)計(jì)在一次PCR反應(yīng)中，這樣既可以節(jié)約試劑用量，同時(shí)也大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并達(dá)到質(zhì)量檢測(cè)的目的。

SNP位點(diǎn)引物PCR結(jié)合連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase?detection?reaction，LDR)技術(shù)是使用多對(duì)引物對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)品系間特異性單核苷酸位點(diǎn)，構(gòu)建不同長(zhǎng)度的LDR特異探針，利用高溫連接酶的高特異性對(duì)基因內(nèi)部的序列差異進(jìn)行檢測(cè)，因而具有高通量，高準(zhǔn)確度，高靈敏度等特性，是一種可移植性很強(qiáng)的檢測(cè)方案。SNP由于具有獨(dú)特的遺傳特性，因此被用來(lái)分析生物遺傳多樣性和親緣關(guān)系。由于探針和引物具有高度敏感性和特異性，使其能對(duì)多個(gè)物種進(jìn)行檢測(cè)分型。

本試劑盒通過(guò)選擇12個(gè)已知SNP位點(diǎn)進(jìn)行品系間遺傳多態(tài)性分析，設(shè)計(jì)12對(duì)位點(diǎn)PCR引物和LDR探針，對(duì)樣本進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增。待檢樣本經(jīng)引物PCR放大后再用連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase?detection?reaction，LDR)來(lái)對(duì)樣本進(jìn)行分型和定量。DNA連接酶催化兩條DNA鏈發(fā)生縮合反應(yīng)生成磷酸二酯鍵。由于要在核苷酸片斷與模板鏈完全配對(duì)的情況下，連接酶才能把缺口連接上，特別是上游片斷的3’端，3’端一個(gè)堿基的錯(cuò)配，也將導(dǎo)致連接反應(yīng)的失敗，所以連接反應(yīng)被用于單堿基突變的研究。在LDR中，只要上下游探針的選取與設(shè)計(jì)恰當(dāng)，就可以保證連接產(chǎn)物的特異性，所以LDR在分型中的應(yīng)用也是很有優(yōu)勢(shì)的。并且多對(duì)探針同時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)，相互之間的干擾也是很小的，我們就可以在一個(gè)樣本中區(qū)分多個(gè)序列。首先，抽提各物種的基因組DNA，定量到統(tǒng)一濃度。其次，在數(shù)據(jù)庫(kù)中選取25個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)4種斑馬魚(yú)品系進(jìn)行分型，從中選取12個(gè)SNP位點(diǎn)，重新設(shè)計(jì)探針，構(gòu)建多重探針檢測(cè)方案，并優(yōu)化方案。再次，用已分型過(guò)的4種斑馬魚(yú)品系和國(guó)外已知斑馬魚(yú)品系對(duì)多重探針檢測(cè)方案做SNP特異性評(píng)估。最后用多重探針檢測(cè)方案檢測(cè)未知斑馬魚(yú)樣本的遺傳質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是建立一種斑馬魚(yú)遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法的多重分型方案試劑盒。

本方法針對(duì)已有SNP位點(diǎn)有效擴(kuò)增出所有目標(biāo)序列，保證了各目標(biāo)序列都可被檢測(cè)到。各目標(biāo)物種的特異探針進(jìn)一步又保證了特異性，使各目標(biāo)序列完全區(qū)分出來(lái)，實(shí)現(xiàn)多重分型定量。

本試劑盒主要由SNP位點(diǎn)引物PCR和特異探針LDR兩部分組成。在PCR中，設(shè)計(jì)的位點(diǎn)引物擴(kuò)增出所選SNP位點(diǎn)序列。再經(jīng)過(guò)連接反應(yīng)，各物種特異的LDR探針達(dá)到分型的目的。LDR信號(hào)由ABI?Prism?377型核酸分析儀檢出，測(cè)得的熒光值作為定性的依據(jù)。

本試劑盒采用的方案包括以下步驟：

1.多重分型方案的獲得

(1)靶標(biāo)SNP的確定、斑馬魚(yú)樣本的獲得

選取的斑馬魚(yú)為T(mén)U、TL、AB、WIK四個(gè)近交系，其中TU為24尾，TL為24尾，AB為14尾，WIK為16尾。在數(shù)據(jù)庫(kù)中選取斑馬魚(yú)25對(duì)染色體上已有的SNP位點(diǎn)作為靶標(biāo)，進(jìn)行分型研究，構(gòu)建多物種聯(lián)合檢測(cè)的PCR體系和多重LDR體系。

(2)SNP位點(diǎn)引物及探針設(shè)計(jì)