[發明專利]提高小麥紋枯病抗性的方法

有效

• 申請號: 201010241551.9
• 申請日: 2010-07-30
• 公開（公告）號: CN101942452A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發明（設計）人: 周淼平;姚金保;任麗娟;楊學明;馬鴻翔
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12Q1/68;A01H5/00;A01G1/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 孫忠浩

1.一種提高小麥紋枯病抗性的方法，是通過PCR方法由擬南芥基因組DNA克隆出擬南芥NPR1基因，其特征在于：

a)利用一對引物SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3通過PCR方法由擬南芥基因組DNA克隆出擬南芥NPR1基因的克隆片段SEQ?ID?NO：1，并構建擬南芥NPR1基因的表達載體；

b)通過基因槍法將擬南芥NPR1基因的表達載體導入受體小麥幼胚細胞；對所述的小麥幼胚細胞進行愈傷誘導、植株再生，獲得轉基因待選植株；

c)對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株；

d)陽性轉基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T₂代轉基因純合株系；

e)對T₂代轉基因純合株系后代進行紋枯病抗性篩選，獲得紋枯病抗性提高的轉基因植株。

2.根據權利要求1所述的提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于：構建擬南芥NPR1基因的表達載體是指：將上、下游分別附加限制性內切酶SmaI和SacI酶切識別DNA序列的克隆片段SEQ?ID?NO：1采用SmaI和SacI酶切后，回收2010bp片段；以pAHC25為基礎質粒，采用限制性內切酶SmaI和SacI對pAHC25質粒DNA進行酶切，回收7.8Kb左右DNA酶切大片段，以T₄DNA連接酶與回收的附加SmaI和SacI酶切位點的SEQ?ID?NO：1的2010bp片段連接，轉化大腸桿菌，對抗100mg/L氨芐青霉素的陽性克隆進行擴增并提取質粒，采用測序和酶切的方法驗證連接的正確性，獲得的質粒命名為pAC-NPR1即為擬南芥NPR1基因的表達載體。

3.根據權利要求1所述的提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于：對轉基因待選植株進行分子檢測，獲得陽性轉基因植株是指：對待選植株通過一對引物SEQ?IDNO：4和SEQ?ID?NO：5進行PCR篩選獲得大小為745bp的擴增片段，通過另一對引物SEQ?ID?NO：6和SEQ?ID?NO：7進行PCR篩選獲得大小為721bp的擴增片段，對所述的兩個擴增片段通過電泳圖檢測，同時含有擬南芥NPR1基因的這兩條擴增片段的植株被確定為陽性轉基因植株。

4.根據權利要求1所述的提高小麥紋枯病抗性的方法，其特征在于：對T₂代轉基因純合株系后代進行紋枯病抗性篩選是指：在小麥拔節期對被測后代采用牙簽接菌法接種紋枯病致病菌株R46，于小麥乳熟期調查紋枯病發病情況，計算株系平均病情指數，根據病情指數判定小麥植株的紋枯病抗性。