[發明專利]一種MHV混合細胞培養多種病毒的培養方法

無效

• 申請號: 201010236929.6
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN102337249A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 居麗雯;蔣露芳;高穎陽;姜晨彥;姜慶五
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴

1.一種MHV混合細胞分離培養多種病毒的培養方法，其特征在于，其包括步驟：

1)選擇培養試劑

細胞生長液為MEM母液加小牛血清，終濃度為10％，加慶大霉素，終濃度24ug/ml，7.5％NaHCO₃調pH至7.0～7.2；

病毒運輸液為MEM母液加牛血清白蛋白，終濃度5ug/ml，加青、鏈霉素終濃度100ug/ml，加兩性霉素終濃度0.5ug；

病毒接種液為MEM母液加牛血清白蛋白終濃度5ug/ml，加青、鏈霉素終濃度50ug/ml，TPCK-胰酶終濃度為2ug/ml；

2)制備培養細胞：

5～15代MDCK細胞、HEP-2細胞和Vero細胞，分別在T75細胞瓶中長成單層細胞；

3)制備MHV混合細胞瓶

采用MDCK、Hep-2、Vero細胞制備混合細胞培養瓶，分離培養呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；腸道病毒中的EV71病毒；

4)標本接種：

鼻咽拭標本處理：鼻咽標本4℃、2000r/min離心5min去除沉淀，0.22微米孔徑濾膜過濾除菌或以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時后接種混合細胞瓶，同時設立陰性對照；

糞便標本處理：糞便標本以1∶5比例懸浮于pH7.2PBS液，2000r/min離心5min去除糞便渣，0.22微米孔徑濾膜過濾除菌再以青/鏈霉素、兩性霉素處理4小時后接種混合細胞瓶，同時設立陰性對照；

5)培養物鑒定：

接種標本24h以后，在倒置顯微鏡下觀察培養細胞致細胞病變效應、熒光顯微鏡下觀察特異蛋白單克隆免疫熒光染色、RT-PCR、PCR擴增產物鑒定。

2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，MDCK、Hep-2、Vero三株細胞分別在T75細胞瓶中長成單層細胞后經EDTA-胰酶消化，分別對MDCK、Hep-2、Vero細胞懸液計數后混合，制成細胞數為1.5×10⁵/ml的細胞懸液，其中每株細胞的細胞數分別為5×10⁴/ml，將上述混合細胞懸液分裝培養瓶中，3ml/瓶，置37℃、5％CO₂溫箱中長成80％左右的細胞單層。

3.按權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的EDTA-胰酶為0.25％EDTA-胰酶。

4.按權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細胞懸液計數采用白細胞計數板。

5.按權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，鼻咽拭標本采用模擬臨床標本，具體制備如下述：

(1)采樣管制備，取3.6ml病毒運輸液加入10ml滅菌試管內；

(2)取-86℃保藏的甲型、乙型流感病毒液、腺病毒液、EV71病毒液各數株，每株病毒液吸取0.4ml加入上述采樣管內1∶10稀釋；

(3)每次隨機選取志愿者，滅菌棉拭子在志愿者咽后壁和扁桃腺兩側輕輕擦拭，置入采樣管內，做成模擬臨床咽拭標本。

6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，采用甲型、乙型流感病毒單克隆免疫熒光抗體IMAGEN^TM?influenza?virus?A?and?B(DAKO)；腺病毒單克隆免疫熒光抗體D3?ultra^TM?DFA?Respiratory?virus?ID?kit(DIAGNOSTIC?HYBRIDS)；泛腸道病毒混合免疫熒光抗體LIGHT?DIAGNOSTICS^TM?Pan-Enterovirus?Reagent，MIILIPORE(chemicon)。

7.按權利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的甲1型流感病毒RT-PCR擴增產物為431BP；乙型流感病毒擴增產物為390bp；腺病毒擴增產物為874bp。