[發明專利]玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201010236729.0
• 申請日: 2010-07-26
• 公開（公告）號: CN102146414A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 聞建平;宇光海;賈曉強
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/76;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/465
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.達托霉素基因工程菌的構建方法，其特征是利用PCR擴增NPRS上下游附屬關鍵基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，將基因片段連接到過表達載體，然后利用結合轉移的方法轉化玫瑰孢鏈霉菌，通過抗生素抗性篩選獲得目的基因工程菌。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征是所述表達載體為整合型載體或高拷貝載體質粒載體。

3.如權利要求1或2所述的構建方法，其特征是所述表達載體中NRPS附屬基因的啟動子為ermE*；表述載體的出發載體為pIB139。

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征是步驟如下：

(1)設計PCR引物擴增NRPS基因上下游附屬關鍵基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ；

(2)將克隆得到的目的基因插入pIB139的組成型強啟動子ermE*下游多克隆位點；

(3)然后將重組質粒導入大腸桿菌ET12567中，以備結合轉移之用；

(4)將大腸桿菌ET12567與玫瑰孢鏈霉菌在MS培養基上37℃共培養20小時，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的無菌水將平板覆蓋，再在30℃培養48小時，篩選轉化子。

5.達托霉素基因工程菌的應用，其特征是：

(1)在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Streptomyces?reseosporus基因工程菌HP-GJ01或HP-EF01的斜面孢子用無菌水制成孢子懸液；

(2)取0.5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養基的250毫升的搖瓶中，30℃，180～220rpm搖床中培養48小時，制備種子液；

(3)以1％～4％的接種量，接種到7.5L自動發酵罐中，在發酵培養中30℃培養，在0～30h，控制pH?6.5，溶氧45％；在30h～144h，控制pH?7.0，通氣量控制0.8v/v/m，30h時以0.10mL/h的速度開始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h開始補加甘油，流速為0.25mL/L·h，發酵144小時；

(4)通過HPLC檢測發酵液中的達托霉素濃度。

6.如權利要求5所述的應用，其特征是所述的培養基組成及質量含量為：

種子液體培養基組成及質量含量為：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O?0.05g，MgSO₄·7H₂O?0.05，CaCO₃?0.02g，溶解到1L蒸餾水中，初始pH?7.0。

7.如權利要求5所述的應用，其特征是所述的發酵培養基組成及質量含量為：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生餅粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄?0.6g/L，初始pH?7.0。

8.達托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為玫瑰孢鏈霉菌(Streptomyces?reseosporus)HP-EF01和HP-GJ01，保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CGMCC?No.3734和CGMCC?No.3733。