[發(fā)明專利]一種快速檢測嗜水氣單胞菌膠體金免疫層析試紙條

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010235526.X
• 申請日: 2010-07-14
• 公開（公告）號: CN102121937A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊海平;辛志明;曾占壯;吳斌;張新艷
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577;G01N33/531;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌膠體金免疫層析檢測試紙條及其制備和在嗜水氣單胞菌檢測上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)在自然界中廣泛分布，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌，臨床急性感染主要表現(xiàn)為出血性敗血癥，慢性感染則主要表現(xiàn)為皮膚潰瘍或腸炎，具有流行廣、發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)，常導(dǎo)致較大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。建立準(zhǔn)確的病原檢測技術(shù)是防控嗜水氣單胞菌危害的基本前提。國內(nèi)對嗜水氣單胞菌的檢測與疾病診斷進(jìn)行了一系列的研究，楊其升通過生化試驗(yàn)鑒定嗜水氣單胞菌；高漢嬌利用直接熒光抗體法檢測鰱魚敗血癥病原嗜水氣單胞菌，吳淑勤等建立了間接熒光抗體技術(shù)檢測鰻鱺嗜水氣單胞菌；陳瓊等利用外毒素HEC制備單克隆技術(shù)檢測嗜水氣單胞菌，錢冬等建立了嗜水氣單胞菌的多克隆抗體ELISA檢測法，檢測靈敏度達(dá)9.77×10⁴cfu·mL^-1，檢測時(shí)間為1.5h左右；朱大玲等建立了檢測aerA和ahpA雙毒力基因檢測致病性嗜水氣單胞菌毒力的PCR檢測方法。已建立的這些方法都存在著不便于基層生產(chǎn)應(yīng)用、設(shè)備要求高、檢測過程時(shí)間長等缺點(diǎn)。

膠體金免疫層析技術(shù)由于其快速、便捷，不需特殊設(shè)備，結(jié)果判斷直觀等優(yōu)勢，越來越受到人們的重視。本發(fā)明利用單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)建立嗜水氣單胞菌膠體金免疫層析快速檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于公開一種嗜水氣單胞菌的膠體金快速檢測試紙條，并提供該試紙條的制備方法與在嗜水氣單胞菌檢測上的應(yīng)用，具有特異、準(zhǔn)確、快速、操作簡單、現(xiàn)場檢測、高通量檢測、易于推廣應(yīng)用的優(yōu)勢。應(yīng)用該試紙條檢測嗜水氣單胞菌全過程不超過15min。

本發(fā)明嗜水氣單胞菌膠體金快速檢測試紙條，是由包被了抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的金標(biāo)墊、包被了抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體或多克隆抗體和兔抗鼠I?gG或葡萄球菌A蛋白或葡萄球菌G蛋白的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水紙、底板等組成，底板上以樣品墊為起始端，依次重疊粘貼固定有樣品墊、金標(biāo)墊、帶有檢測線和質(zhì)控線抗體的硝酸纖維素膜、吸水紙。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

(1)抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體的制備：通過嗜水氣單胞菌滅活抗原免疫Balb/c小鼠，制備脾細(xì)胞懸液、骨髓瘤細(xì)胞懸液；將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞雜交融合，篩選陽性單克隆細(xì)胞孔；經(jīng)進(jìn)一步的陽性克隆化及其篩選，建立抗遲緩愛德華氏菌陽性、特異性好的細(xì)胞株1株，命名為AhMcAb?1F3。取雜交瘤細(xì)胞株AhMcAb?1F3在培養(yǎng)后腹腔注射Balb/c小鼠制備腹水，并經(jīng)過純化獲得抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體AhMcAb?1F3；

(2)納米膠體金的制備：將100mL?0.01％氯金酸用1mL?1％檸檬酸三鈉制備納米膠體金顆粒；

(3)抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體AhMcAb?1F?3的膠體金標(biāo)記物制備：用0.1mol·L?K₂CO₃將上述膠體金溶液的pH值調(diào)至8.5，將膠體金溶液與抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體AhMcAb?1F3按100mL膠體金溶液加入0.2mg單克隆抗體的比例混合均勻，并使膠體金與抗體形成穩(wěn)定的膠體金復(fù)合物，在通過純化、濃縮?后形成膠體金標(biāo)記物；

(4)兔抗嗜水氣單胞菌多克隆抗體的制備：用嗜水氣單胞菌滅活菌抗原多次免疫新西蘭兔，獲得兔抗嗜水氣單胞菌多克隆抗體血清，純化兔抗嗜水氣單胞菌多克隆抗體；

(5)將嗜水氣單胞菌單克隆抗體AhMcAb?1F3膠體金標(biāo)記物噴涂在金標(biāo)墊上，將兔抗嗜水氣單胞菌多克隆抗體和兔抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線位置上，在37℃干燥箱烘干；

(6)將噴涂有檢測線與質(zhì)控線抗體的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙等依次粘在底板上；

(7)將依次粘好的底板材料切成裁切成寬×長為0.35cm×6cm的長條即為嗜水氣單胞菌膠體金免疫層析檢測試紙條，包裝備用。本發(fā)明的積極效果在于：

(1)低價(jià)格：產(chǎn)品生產(chǎn)流程簡單，生產(chǎn)成本低；

(2)檢測速度快：全過程15min內(nèi)完成；

(3)可以生產(chǎn)現(xiàn)場檢測、高通量檢測；

(4)高質(zhì)量：本方法制備而成的試紙條特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好；

(5)操作簡單：本方法制備而成的試紙條以膠體金作為指示標(biāo)記，快速定性，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，操作簡便，只需要加樣檢測與結(jié)果記錄步驟；