[發明專利]同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法

有效

• 申請號: 201010235095.7
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN101946699A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 康喜亮;王曉軍;郝秀英;劉敏;波拉提;徐琴
• 申請（專利權）人: 中國科學院新疆理化技術研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

1.一種同源四倍體天山雪蓮植株的培育方法，其特征在于按下列步驟進行：

a、將天山雪蓮種子用溫水浸泡20min，再用75％乙醇表面消毒20-50sec，然后用15％H₂O₂溶液消毒15-50min，將消毒后的種子用無菌水漂洗2-5次，再播種于MS培養基上，每瓶MS培養基播種10-30粒種子，7-15天后雪蓮種子即可萌發產生無菌苗；

b、將步驟a中萌發生長的無菌苗切除其根部和葉片，保留下胚軸莖段部分；

c、將步驟b中下胚軸莖段接種于添加有2％二甲基亞砜和濃度為0-0.20％秋水仙素的出芽誘導培養基上處理1-3d，培養溫度25-30℃，光照強度50μmol·m^-2·s^-1，光照時間16h·d^-1，出芽誘導培養基為MS+BA0.3-0.5mg/L+TDZ0.3-0.5mg/L+NAA0.05-0.1mg/L；

d、將步驟c中處理過的下胚軸莖段轉入MS+BA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L增殖培養基中培養25-30d，培養溫度20±1℃，光照強度50μmol·m^-2·s^-1，光照時間16h·d^-1；

e、將步驟d中增殖的苗切成單芽后轉接至1/2MS+NAA0.05-0.2mg/L生根培養基中生根；

f、天山雪蓮同源四倍體的篩選：將步驟e中的植株與二倍體對照植株做對比分析，根據二者在外觀形態如葉片寬度、葉面積以及解剖結構上氣孔保衛細胞的大小和密度之間的差異，初步確定為同源四倍體植株；

g、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之一：隨機剪取步驟e中植株的幼嫩根尖和幼嫩不定芽莖尖組織，在溫度0-4℃，經過0.002mol/L?8-羥基喹啉預處理或飽和對二氯苯水溶液預處理，卡諾固定液固定，溫度60℃，1-2mol/L鹽酸解離6-15min，改良苯酚品紅染色液染色10-15min，壓片觀察統計根尖、幼嫩不定芽莖尖染色體，初步確定為同源四倍體植株；

h、天山雪蓮同源四倍體的鑒定之二：隨機剪取步驟e中部分植株的葉片，于常溫下在裝有3-5ml細胞核提取緩沖液的培養皿中用剪刀將其剪碎，200目尼龍網過濾，500-1000r·min^～1離心漂洗3次，流式細胞儀檢測確定為同源四倍體植株；

i、天山雪蓮同源四倍體的移植：將步驟e中培育的植株洗去根部附著的殘留培養基，定植于草炭土∶珍珠巖∶蛭石＝3∶1∶1的溫室苗床上，搭建拱棚，附上薄膜，每天通風一次，每次30min，每兩天澆水一次，一周后，撤去薄膜和拱棚，定期澆水，溫室培養，天山雪蓮同源四倍體植株煉苗移栽成活率達82％。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c、d和e中的培養基均為固體培養基。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟g中8-羥基喹啉預處理時間為2-6h，飽和對二氯苯水溶液預處理時間為5-10h，卡諾固定液固定時間為12-36h。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟i溫室苗床濕度為60％，溫室培養溫度控制在20-22℃。