[發明專利]基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法

無效

• 申請號: 201010235051.4
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN101906423A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 李佳楠;湯華東
• 申請（專利權）人: 江漢大學;武漢海特生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/866;C12N7/01;C07K14/48
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 俞鴻

1.一種基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法，其步驟是：

(1)將編碼人神經生長因子的基因可操作地連接于表達載體Bacmid，構建表達人神經生長因子的重組表達載體；

(2)所述重組表達載體轉染昆蟲細胞，收獲重組病毒顆粒，構建表達人神經生長因子的昆蟲表達系統；

(3)培養昆蟲細胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經生長因子。

2.如權利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法，其特征是：所述步驟(1)的方法是：

(1.1)將人神經生長因子基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入pFastBac^TMDual質粒，構建pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重組質粒，轉化大腸桿菌JM109菌株，篩選重組子，提取pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重組質粒，經PCR與酶切鑒定插入正確后，測序驗證其序列正確性；

(1.2)將上述鑒定正確的pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]質粒轉化含有Bacmid質粒的大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，挑取陽性克隆，獲取含重組人神經生長因子基因的穿梭質粒Bacmid+[rhβ-NGF]，經PCR鑒定后再經測序驗證其序列正確性；

所述人神經生長因子基因片段是：

ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAGAGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGCTGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGACTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA

氨基酸序列是：

MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARYAGQTRNITYDPRLFKKRRLRSPRYLFSTQPPREAADTQDLDFEYGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSYCDSVSYWYGDKTTADIKGKEVMVLGEYNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWBSTCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACYCYLSRKAYRRA-

3.如權利要求2所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法，其特征是：構建pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重組質粒的方法是：在構建pFastBac^TMDual質粒后，利用T₄DNA?ligase連接構建得到pFastBac^TMDual+[rhβ-NGF]重組質粒。

4.如權利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的制備方法，其特征是：所述步驟(2)的方法是：

(2.1)取對數生長期的昆蟲細胞sf9，用含rhβ-NGF的穿梭質粒Bacmid和脂質體轉染試劑cellfection2000混合進行轉染；

(2.2)轉染后的sf9細胞因Bacmid+[rhβ-NGF]質粒的表達而產生昆蟲病毒顆粒，并使sf9細胞裂解；

(2.3)收獲細胞培養上清，其中含有攜帶重組人神經生長因子的昆蟲桿狀病毒顆粒及少量重組人神經生長因子。