[發明專利]文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因及其應用

有效

• 申請號: 201010234879.8
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN101914545A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 徐安龍;黃功華;鄭婷婷;韓燕;元少春;董美玲
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/46;A61K38/17;A61P31/00
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 華輝

1.通過引物擴增基因片段和RACE基因UTR序列的方法，從文昌魚總RNA中克隆得到文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

2.由權利要求1所述的文昌魚富含亮氨酸蛋白ALM基因編碼的富含亮氨酸蛋白ALM，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。

3.重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的表達方法，其特征在于：根據權利要求2所述的富含亮氨酸蛋白ALM的結構域，通過表達載體pET-21b，分段在大腸桿菌中以胞內包涵體的形式表達。

4.根據權利要求3所述的表達方法，包括以下步驟：

1)重組表達載體pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的構建；

2)將重組表達載體pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)；

3)對轉化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)進行培養；

4)重組文昌魚非融合蛋白LRR1、LRR2和LRR3的提取和變復性處理。

5.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于，在步驟1)中所述的重組表達載體pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3的構建包括以下步驟：

a)依據權利要求1所述的ALM基因的序列和權利要求2所述的ALM蛋白的結構，合成三對引物，LRR1上游引物LRR1-up為5’atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR1下游引物LRR1-low為5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR2上游引物LRR2-up為5’-atGGATCCGATGCTACAACTCAACAACAAC-3’，LRR2下游引物LRR2-low為5’-taCTCGAGCCGAGGACGGAAAAGTTCAG-3’，LRR3上游引物LRR3-up為5’-atGGATCCTATGAGCGACGTCTGCTACTG-3’，LRR3下游引物LRR3-low為5’-taCTCGAGCCGCAGAACAGACAGGACATC-3’，其中，上游引物均含有BamH?I切割位點，下游引物均含有Xho?I切割位點；

b)以含有ALM基因的pGEM?T?easy?vector質粒為模板，以LRR1-up和LRR1-low、LRR2-up和LRR2-low、LRR3-up和LRR3-low為引物，高保真聚合酶PCR擴增基因片段；

c)將PCR擴增產物克隆到原核融合表達載體pET-21b上，得到重組表達載體pET-21b-LRR1、pET-21b-LRR2和pET-21b-LRR3。

6.根據權利要求4所述的表達方法，其特征在于，步驟3)的培養條件為：將單菌落接種于10ml含有100mg/L氨芐青霉素抗性LB液體加富培養基中，37℃劇烈震蕩培養16小時，作為種子菌；取種子菌按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素的LB液體加富培養基中，37℃劇烈震蕩放大培養至OD₆₀₀約為0.5～0.6；加入終濃度為0.5mM的IPTG，37℃誘導表達6小時；4℃、8000rpm離心15分鐘，收集菌體。