[發明專利]抗人心肌肌鈣蛋白I特異性單克隆抗體及其制備方法

無效

• 申請號: 201010234224.0
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN101942416A
• 公開（公告）日: 2011-01-12
• 發明（設計）人: 王德芝;張春明;楊磊;郝建秀;李玉彬;宋娜玲;賀欣;劉鑒峰;佘義;王沂;馮麗娜
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院放射醫學研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明涉及以抗體為特征的體外實驗用的生物制品，更具體的說，是一種抗人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)特異性高的單克隆抗體及其制備方法與應用。

背景技術：

急性心肌梗死(AMI)的早期診斷和及時治療是降低死亡率的關鍵。心肌組織特異性標志物的測定是AMI診斷、監測病程與評價預后的主要指標。傳統使用的早期標志物為肌紅蛋白(Mb)、乳酸脫氫酶(LDH)同工酶、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)等，臨床實踐證實這些心肌損傷標志物大都存在特異性不強、升高時間較晚和持續時間相對短等缺陷。近年來，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)以其高度的靈敏性和組織器官特異性及較長的診斷窗口期，在AMI和其他心臟疾病的診斷中顯示出其特殊的優越性，并愈來愈多的受到臨床醫生和臨床化學家的關注和青睞。國際臨床化學聯盟(IFCC)的心肌標志物標準化委員會(CSCM)的美國臨床生化學院(NACB)最近建議在臨床工作中將心肌肌鈣蛋白I作為急性心肌梗死診斷的“金標準”。

目前，我國臨床上使用的cTnI診斷試劑盒多為進口產品、或進口原料國內組裝。這些進口產品價格昂貴，限制了這一特異、靈敏的生化標志物在國內的廣泛推廣和應用。研制出具有自主知識產權、完全國產化的cTnI診斷試劑盒是當前急需。我們圍繞cTnI檢測試劑盒的國產化進行了深入的研究和探索。在研究中發現有兩個問題嚴重制約著cTnI診斷試劑盒的國產化進程：(1)首先是試劑盒的重要組成成分cTnI抗原的來源問題，傳統的方法是從猝死者心肌組織中采用生化方法提取，但目前人心肌組織的來源及其困難，且質量也難以保證，致使其產率極低，抗原活性也不理想。(2)試劑盒的關鍵試劑抗體特異性：多克隆抗體結合位點多，特異性、均質性相對弱，制備出用于心血管疾病臨床診斷的高親和力、高特異性的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體是解決問題的關鍵。

隨著分子生物學和基因重組技術的飛速發展，有關體外表達重組人心肌肌鈣蛋白I(，rhcTnI)的文獻在國內外均有報道。但大部分研究工作還處在實驗室的階段，至目前為止尚未見商品化的重組人心肌肌鈣蛋白I問世。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株B10A6其保藏號為：CGMCC?NO?3951。

本發明的另一個目的是提供一種由抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株CGMCC3951分泌的單克隆抗體。

本發明的再一個目的是提供一種抗cTnI單克隆抗體的制備方法。

為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：

一種抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株B10A6其保藏號為：CGMCC?NO?3951。

抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株B10A6，該雜交瘤細胞株于2010年06月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。保臧號為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC?NO?3951。

本發明所述的抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株，該細胞株，能分泌抗人心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體。

本發明提供了由抗人心肌肌鈣蛋白I雜交瘤細胞株CGMCC3951分泌的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體免疫球蛋白類別及亞類分別為IgG和IgG3且與人心肌肌鈣蛋白I特異結合；其效價為1∶16000，親和常數：1.08×10^-9mol/L。

本發明所述抗人心肌肌鈣蛋白I特異性單克隆抗體的DNA基因序列為679bp，如圖3所示。其所編碼的氨基酸序列如圖11所示。該cTnI抗體-免疫球蛋白IgG分子量約為150kD，由兩條分子量約為50kD的重鏈和兩條分子量為25kD的輕鏈組成(如圖9)。

本發明采用RT-PCR方法從人心肌組織總RNA中克隆出全長的人心肌肌鈣蛋白I基因，將其插入到pMD19-T克隆載體中，經酶切和測序對目的基因分析，再插入到pET-21a(+)表達載體中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，對誘導表達的目的蛋白行SDS-PAGE和采用銳普心梗儀檢測重組蛋白的抗原性并準確定量。從已構建的重組人cTnI的基因工程菌表達蛋白中分離純化cTnI作為抗原免疫Balb/c小鼠，取鼠脾細胞同Sp2/0骨髓瘤細胞融合，利用選擇培養基篩選融合的雜交瘤細胞，采用有限稀釋法分離獲得能夠穩定分泌抗cTnI的McAb陽性克隆，并利用體內誘生法大規模制備McAb，辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體，鑒定抗體的性質。

附圖說明：