[發明專利]一種H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010234168.0
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN101914632A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 柴同杰;呂靜;姚美玲
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發明涉及H9亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法。

(二)發明背景

禽流感是由正粘病毒科禽流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病，根據其血凝素HA和神經氨酸酶NA的抗原性將禽流感病毒分成不同亞型，包括15種特異的HA亞型和9種特異的NA亞型，兩者的不同組合形成不同亞型禽流感病毒。根據毒株致病性的不同，禽流感可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感兩大類。H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，產蛋家禽感染后，可引起產蛋率下降，軟殼蛋、無殼蛋增多，嚴重的將會停止產蛋。種禽感染后，除上述癥狀外，還表現出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雛禽出殼困難，出殼后的雛禽弱雛增多。雛禽在一周內死亡率較高，且易感染大腸桿菌，治療較困難。H9亞型禽流感混合感染其他病原時，可導致發病率和死亡率的大幅度提高，給養殖業帶來巨大損失。近年來，H9亞型禽流感病毒感染人的病例也時有發生，因此它也是不容忽視的人獸共患病病原。

H9亞型禽流感傳播快，危害大，因此早期快速診斷就成為預防和控制該病的前提條件。根據其流行特點、臨診表現和病理變化可作出初步診斷，確診還需要進行實驗室診斷，傳統的實驗室檢測方法主要是血清學檢測。血清學檢測具有精確、敏感的優點，但操作繁瑣，耗時較長，約需要一周左右的時間才能確診。基于分子生物學技術的熒光定量RT-PCR方法，能夠快速準確的對樣品進行檢測，對疾病的早期治療及疫情的控制提供參考。

(三)發明內容

本發明建立了靈敏度高、特異性強、操作簡單的H9亞型禽流感熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法速度快、高通量，能大大縮短檢測周期，為疾病的治療和疫情的控制提供保障，并能避免檢測過程中可能造成的生物污染。

本發明的具體步驟是：

1、引物設計

參照GenBank中公開發表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列，應用Primer?Premier?5.0軟件設計了特異性引物序列：

名稱????????核苷酸序列(5’-3’)??????????????????????????位置

H9F-1???????ACCAGTGCATGGAGACAATTC????????????????????????1484-1504

H9R-1???????CAAATGTTGCATCTGCAAGAC????????????????????????1709-1689

H9F-2???????AAGCTGGAATCTGAAGGAACTTACA????????????????????1576-1600

H9R-2???????ATTGGACATGGCCCAGAACA?????????????????????????1609-1639

H9-probe????FAM-ACCATTTATTCGACTGTCGCCTCATCTCTTG-TAMRA????1686-1667

2、病毒RNA提取

①取H9N2亞型禽流感病毒懸液250μL，加入750μLTrizol液，混勻；

②室溫放置5min，然后以每1ml?Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；

③取上層水相于一新的離心管，按每ml?Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min；

④棄去上清液，按每ml?Trizol液加入至少1ml的比例加入75％乙醇，混勻，4℃下7500g離心5min；

⑤重復④中的操作；

⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度；

⑦然后將RNA溶于無RNA酶水中，放置10min。提取的RNA須在2h內進行PCR擴增，若需長期保存須放置-70℃冰箱。

3、RT-PCR擴增

①反轉錄合成cDNA：反轉錄反應體系包括：10×RT?mix?2μl，2.5mM?dNTPs?2μl，2μl?U-12禽流感通用反轉錄引物(5`-AGCAAAAGCAGG-3`)，Quant?Reverse?Transcriptase?1μl，5μl已制備的RNA，DEPC水8μl。37℃作用1h，即反轉錄完成。