[發(fā)明專利]一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010234139.4
• 申請日: 2010-07-23
• 公開（公告）號: CN101921807A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何勇;周峻;竇科峰;李海民;陳勇;王德盛;岳樹強(qiáng);趙威;周景師;曹大勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/88
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肝病基因醫(yī)療領(lǐng)域，尤其涉及一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

在世界范圍內(nèi)，肝硬化已成為僅次于心腦血管病和惡性腫瘤的重大疾病，對人類危害極大。我國每年肝硬化病人逾100萬，而且治療效果不佳，病人一旦進(jìn)入失代償期，5年生存率極低。各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都存在肝纖維化，其中25％-40％最終發(fā)展為肝硬化及至肝癌，而且，肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，能否將病變終止于肝纖維化階段甚至逆轉(zhuǎn)至正常，是治療肝病的關(guān)鍵。但在實際工作中，對肝纖維化治療仍缺乏有效辦法，積極尋找肝纖維化治療的新方法，具有重要的現(xiàn)實意義與社會意義。

目前的研究證實，在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中，有兩方面的因素起主要作用，一是肝細(xì)胞的損傷，二是肝星狀細(xì)胞(HSC)的過度活化。

針對肝纖維化發(fā)病過程中肝細(xì)胞損傷和HSC過度活化這兩種主要病因，以及肝細(xì)胞生長因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)這兩種細(xì)胞因子在肝纖維化中的重要作用，許多學(xué)者利用HGF和TGF-β1這兩種基因，用基因治療的方法進(jìn)行肝纖維化治療的實驗研究。

但這些治療方法都有一定的欠缺，首先都是選用單一的治療基因，其治療效果難以令人滿意，目前研究結(jié)果提示：肝臟內(nèi)HGF與TGF-β1平衡遭受破壞是誘發(fā)肝纖維化的一個重要因素，已如上述，TGF-β1可看作是與肝纖維化相關(guān)的最強(qiáng)有力的細(xì)胞因子，它可使纖維組織積累并抑制其分解系統(tǒng)。于肝硬化組織，可以證實TGF-β1有過剩表達(dá)，而HGF卻反而表達(dá)低下。在反復(fù)發(fā)生的肝損害，作為重要的肝損傷修復(fù)因子本應(yīng)高表達(dá)的HGF，卻因某種原因而低下，從而導(dǎo)致肝纖維積累。曾有報告TGF-β1可以抑制HGF?mRNA表達(dá)，這可能是HGF表達(dá)低下的原因。另據(jù)Ueki等的研究，又已確認(rèn)HGF則能抑制TGF-β1表達(dá)。在生理狀態(tài)下，HGF和TGF-β1可能互輔相成共同調(diào)節(jié)以抑制炎癥與調(diào)整再生，而因炎癥持續(xù)等機(jī)制造成這一平衡破壞時，即可導(dǎo)致纖維組織趨于積累而形成肝纖維化。針對這一狀況，我們聯(lián)合應(yīng)用了反義TGFβ1和正義HGF基因進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，恢復(fù)受損傷肝臟內(nèi)HGF與TGF-β1平衡關(guān)系，以期在修復(fù)肝細(xì)胞損傷的同時又能抑制肝星狀細(xì)胞的過度活化，希望收到理想的療效。

另外目前肝臟基因治療中常用的轉(zhuǎn)染載體肝特異性差，轉(zhuǎn)染率低，影響了療效。目前常用的肝細(xì)胞及肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)基因方法主要有：1、采用病毒載體法如：腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，2、非病毒載體法如：脂質(zhì)體，去唾液酸一聚賴氨酸(ASoR-PL)復(fù)合體等。3、單純cDNA質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法等。三者比較，病毒載體基因轉(zhuǎn)染效率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但體內(nèi)應(yīng)用宜導(dǎo)致受體補(bǔ)體介導(dǎo)的抗病毒免疫排斥反應(yīng)，從而影響其反復(fù)體內(nèi)應(yīng)用，及表達(dá)效率與表達(dá)時間。另外其定向性差，安全性也一直受到關(guān)注；非病毒載體，具有安全、可反復(fù)體內(nèi)應(yīng)用，易與其他抗體結(jié)合、增加定向性的優(yōu)點，但其基因轉(zhuǎn)移效率較病毒載體低；質(zhì)粒與cDNA直接注入法最為簡單，便于使用，但較前二者其基因轉(zhuǎn)移效率最低表達(dá)時間最短。

因此現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種復(fù)合型肝臟內(nèi)定向基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟A1，腺病毒HGF，asTGFβ1載體構(gòu)建；A2，甲殼糖包裹pAdV.CMV-HGF-asTGFβ1納米微囊病毒載體復(fù)合體構(gòu)建；A3，納米微囊-pAdV.CMV-HGF-asTGFβ1復(fù)合體外包被去唾液酸糖蛋白AsOR。

所述的構(gòu)建方法，所述步驟A1具體執(zhí)行以下操作：采用腺病毒質(zhì)粒，pAd.CMV及目標(biāo)基因質(zhì)粒PCL-HGF，PCBL-asTGFβ1，經(jīng)酶切連接，重組構(gòu)建pAd.CMV-HGF-asTGFβ1腺病毒LacZ，Luciferase?gene轉(zhuǎn)染載體；經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，擴(kuò)增，提取；所得部分pAd.CMV-HGF-asTGFβ1質(zhì)粒，與含白蛋白啟動子和增強(qiáng)子的缺陷型pJM17重組，產(chǎn)生完整的病毒基因組DNA，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行AdV病毒包裝后，提取pAdV.CMV-HGF-asTGFβ1。