[發明專利]一種新的大鼠胰腺導管上皮細胞原代培養方法

無效

• 申請號: 201010233969.5
• 申請日: 2010-07-14
• 公開（公告）號: CN101955909A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 周總光;陳珂玲;李園;鄭雪蓮
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 李高峽

技術領域

本發明涉及一種新的大鼠胰腺導管上皮細胞原代培養方法，屬于細胞生物學及生物技術學領域。

背景技術

胰腺導管上皮細胞(Pancreatic?duct?epithelial?cells，PDEC)與多數常見的胰腺類疾病，如胰腺癌、胰腺炎、糖尿病等關系密切。據報道，90％以上的胰腺癌起源于胰腺導管上皮細胞，而在急性胰腺炎的始發環節中胰腺導管上皮細胞不僅起到粘液屏障的作用，還能分泌含有高濃度HCO₃^-的堿液抑制胰蛋白酶的活性，以防止胰腺的自身消化。近年來，熱點研究關注于將自身胰腺導管上皮細胞誘導分化為胰島細胞，有望解決可移植胰島來源少及排異反應等問題，其在糖尿病治療中的潛在價值逐步得到體現。因此，建立一個良好的體外原代培養胰腺導管上皮細胞的體系，可為探索腫瘤轉移、免疫始發及細胞分化等分子機制提供可靠的實驗基礎。

目前培養胰腺導管上皮細胞的方法包括酶消化法和組織塊貼壁法，動物來源多為牛、豬等大型動物，成本較高、來源較少且難以進行大規模實驗，而組織塊貼壁法尚有周期較長、成纖維細胞污染嚴重等缺點。大鼠作為目前最常見的實驗動物之一，其繁殖率高，價格便宜，且與人類基因組有很大相似性。然而，由于大鼠的胰腺導管結構細小、上皮來源少、對酶消化敏感等特性，使其在胰腺類疾病體外研究中的應用受到了一定限制。已有文獻報道了大鼠的胰腺導管上皮細胞的培養、分離、純化方法，如：劉濤，等，大鼠胰腺導管上皮細胞體外分離與定向分化，《中華器官移植雜志》，2007年28卷8期，報道了分離和純化大鼠的胰腺導管上皮細胞，在體外培養并誘導其向胰島細胞定向分化。該方法取整個胰腺，采用膠原酶逆行灌注法消化、Ficoll密度梯度離心結合不同細胞貼壁差異性分離和純化胰腺導管上皮細胞；結果CK-19染色結果證實所獲細胞絕大多為導管上皮細胞。結論：采用密度梯度離心結合差異貼壁法可獲得純化的大鼠胰腺導管上皮細胞。陳錦鵬，等，大鼠胰腺導管上皮細胞體外誘導分化，《江蘇醫藥》，2008年34卷11期，也是取整個胰腺進行消化，采用Ficoll密度梯度離心法；上述報道的方法均是采用分離液方法，成本高，不利于大規模應用。龍愛梅，等，SD大鼠胰腺導管上皮細胞培養技術的研究，《江西醫學院學報》，2005年45卷6期，分離純化SD大鼠胰腺導管上皮細胞，為將其轉分化為胰島細胞提供細胞來源。方法：用酶消化法培養SD大鼠胰腺導管上皮細胞，觀察細胞增殖動態，用CK-19進行免疫組化鑒定。結果：胰腺導管上皮細胞可在體外有效擴增，有效去除成纖維細胞是擴增的關鍵。結論：低血清培養和反復貼壁法可獲得較純的胰腺導管上皮細胞。該方法取整個胰腺進行培養，且僅使用IV型膠原酶。侯敏，等，人胰腺導管上皮細胞的原代和傳代培養，《解剖學報》，2000年31卷2期取整個胰腺，采用混合消化酶進行消化，消化液為Hanks平衡液中加入膠原酶IA型(Sigma)0.5g/L，大豆胰酶抑制劑(Sigma)使其終濃度為0.01％，該文獻報道的方法雖然運用混合消化酶，但是消化過程并未分段，致使有些已經過度消化，而有些還未消化充分。此外，其它報道的方法多是取用整個胰腺組織進行消化，消化過程中不分段，或是不同的步驟采用不同酶消化。采用整個胰腺的納入會造成其他種類的細胞，特別是成纖維細胞污染的可能會大大增加；不分步消化，會使有些細胞還未消化出來，而有些細胞已經因消化過度而成碎片，降低細胞產量。Ficoll密度梯度離心法，成本高，不適合大規模生產；組織塊培養法時間長，且其余細胞污染嚴重。怎樣準確地獲取實驗材料、怎樣適度地控制酶消化步驟、怎樣有效地去除成纖維細胞污染等技術性的難題，目前仍存在爭議。

發明內容

本發明的技術方案是提供了一種新的大鼠胰腺導管上皮細胞原代培養方法。

本發明提供了一種大鼠胰腺導管上皮細胞原代培養方法，它包括以下工藝步驟：

a、從健康大鼠胰腺組織中分離主胰管；

b、使用混合消化酶分步消化法對胰管組織碎塊進行消化分離，獲取細胞團；所述的分步消化法為：

①取清洗后的胰管剪為碎塊，加入胰管碎塊4-5倍體積的混合消化酶消化10-15分鐘，加入HBSS溶液吹打、清洗，自然沉淀，棄去上清液；加入剩余胰管碎塊2-2.5倍體積的混合消化酶消化5分鐘，胎牛血清FBS終止消化，自然沉淀后棄去上清液；