[發明專利]鑒別轉基因抗蟲棉南農6號的PCR檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201010233893.6
• 申請日: 2010-07-19
• 公開（公告）號: CN101899513A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 謝家建;孫爻;蘇長青;彭于發
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種鑒別轉基因抗蟲棉南農6號的PCR方法及其應用。

背景技術

我國是轉基因作物的主要種植國家之一，2009年轉基因作物種植總面積位居全球第六位。目前我國已經批準商業化種植的轉基因作物包括轉基因抗蟲棉花、抗木瓜環斑病毒的轉基因番木瓜等。其中，轉Bt基因抗蟲棉是我國種植面積最大的轉基因作物，2009年種植面積達370萬公頃，占我國棉花種植總面積的近70％。

南農6號是南京農業大學棉花研究所選育的轉基因抗蟲雜交棉組合。2005年通過國家農作物品種審定委員會審定并定名(審定編號：國審棉2005016)，并申請國家植物新品種保護(公告號為CNA002866E)。截止2008年，轉基因棉南農6號獲得了湖南、河南、江蘇、江西、浙江等5省的農業轉基因生物生產應用安全證書，示范、推廣315萬畝(張天真，高產、雄性不育化制種的轉Bt基因抗蟲雜交棉“南農6號”的示范推廣，《中國科技成果》2008年12期)。目前在我國已經批準了多個轉基因棉花品種的商業化種植，開發快速、特異的檢測方法來鑒別不同的轉基因品種，對知識產權保護和轉基因安全的監管都顯得十分必要和緊迫。

目前，PCR技術是轉基因作物檢測中應用最為廣泛的技術。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據其擴增的靶標區域和特異性將其分為四類：一、篩選檢測，以轉基因通用的外源啟動子和終止子為靶標區域；二、基因特異性檢測，以特異的外源目的基因為靶標區域；三、構建特異性檢測，以轉基因元件之間的特異構建為靶標區域；四、轉化體特異性檢測，以轉化體特異性片段(外源插入片段與受體基因組連接區域)為靶標區域。這四類檢測方法對轉基因作物的檢測特異性是逐漸增加的，轉化體特異性檢測是目前對轉基因品系檢測特異性最高的檢測方法，也是目前轉基因檢測中最常用的身份檢測方法，這種檢測方法甚至能夠區分同一轉化載體產生的不同轉化植株品系。

目前我國批準種植的棉花品種中，僅MON531和GK12的轉化體特異性序列和轉化體特異性檢測方法已經有報道，而轉基因棉南農6號的轉化體特異性序列和轉化體特異性檢測方法尚未見報道。

發明內容

針對上述領域中的空白，提供了轉基因抗蟲棉南農6號的轉化體特異性PCR檢測方法，該PCR方法利用普通的PCR儀器、試劑快速準確鑒別出轉基因抗蟲棉南農6號，以及以南農6號為親本的棉花品系。

一種鑒別轉基因抗蟲棉南農6號的PCR檢測方法，其特征在于PCR正向引物依據SEQ?IDNO.1所示核苷酸序列的1-449位堿基序列設計，反向引物依據SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列的450-2247位堿基序列設計，擴增靶標為正反向引物序列在SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列上的識別位置之間的核苷酸序列。

所述正向引物為NN6-F1：5‘-AACTGTAATGACTCCGCGCA-3’，

所述反向引物為NN6-R1：5‘-GACGGGCAACACTAATTAAGAC-3’，擴增區域位于SEQID?NO1的274-514位，擴增產物大小為241bp。

所述PCR檢測方法在鑒別南農6號以及以南農6號為親本的棉花品種上的應用。

本發明的發明人通過Genome?walking方法擴增獲得了南農6號的轉化體特異性序列，如SEQ?ID?NO.1所示，所謂轉化體特異性序列指南農6號這個轉基因品系所唯一擁有的序列，這種唯一性由外源轉化載序列以及外源轉化載體在宿主基因組的特定插入位置決定。在轉基因過程中，外源基因可能插入到宿主基因組的很多個位置，外源基因插入位置不同將得到不同的轉基因品系，即得到不同的轉化體特異性。本發明獲得的轉化體特異性序列的5’端1～449bp為外源轉化載體序列，3’端450-2247bp位置為宿主棉花的基因組序列。基于轉化體特異性片段與轉基因品系的一一對應性，通過在該特異性序列上設計引物，正向引物設計在1～449bp位置，反向引物設計在3’端450～2247bp位置，采用這對正反向引物對待測品系的基因組進行PCR擴增，是一種檢測未知棉花品系是否是南農6號及其子代的有效手段。在檢測中，由于設計的正反向引物的正確靶標序列就是其設計所依據的轉化體特異性序列，即SEQ?ID?NO.1，即事先已經非常清楚引物在靶標序列上的識別位置和靶標序列片段長度，因此能夠預先計算出擴增產物應該為多長，當某個待測品系的基因組擴增產物出現相應長度的擴增片段時，說明該品系就是南農6號或者以南農6號為親本的棉花品種。