[發明專利]一種檢測轉Bt基因作物的核酸恒溫擴增試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201010233362.7
• 申請日: 2010-07-22
• 公開（公告）號: CN101906475A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 汪琳;賴平安;柏亞鐸;羅英;周琦;蒲靜;張偉;高志強;張向東;齊瑋;凌鳳俊;張瑞宏;李東燕;喬彩霞;吳丹;谷強;張利峰;段向英;劉輝
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;物思科技發展(北京)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基于Bt基因Cry1Ac序列和核酸免疫試紙條的一種快速檢測轉Bt基因作物的方法，尤指在反應結束后無需任何儀器、而直接用核酸免疫試紙條簡單快速的對結果進行判定的檢測轉Bt基因作物的核酸恒溫擴增方法和試劑盒。已有的專利是基于蛋白免疫試紙條對Bt蛋白進行檢測，在一定程度上具有局限性，而且靈敏度也不高。我們通過選擇Bt基因的Cry1Ac序列設計引物，利用恒溫擴增方法，而且采用核酸免疫試紙條對結果進行檢測，反應結束后無需任何特殊儀器，結果判讀直觀明確快速，采用基因檢測不僅大大提高了檢測的靈敏度，而且操作簡單、快速。適用于對轉Bt基因作物的簡單、快速檢測，可用于檢測機構實驗室對于進出口商品的標識復驗，轉基因育種研究單位對轉基因作物田間快速篩查等，屬于檢驗檢疫領域。

背景技術

轉基因技術使開發農作物新品種的時間大為縮短，研究人員利用轉基因技術培育出了抗除草劑、抗干旱、耐鹽堿、抗重金屬和抗病蟲害、營養價值高的品種，這對于提高糧食產量、減少收獲后損失以及增加農產品營養價值具有重要作用。隨著轉基因技術的發展，越來越多的轉Bt基因作物新品種被培育出來。美國、巴西等國家和地區相繼批準了轉Bt基因作物進入商業化生產，種植面積急劇擴大。然而轉Bt基因作物在帶來巨大社會和經濟效益的同時也存在許多問題，主要集中在轉基因食品的安全性及對生態環境的安全性方面。

轉基因食品對人類健康及生態環境的潛在影響日益受到人們的普遍關注，轉基因食品的安全性不容忽視。世界各國都在加強對轉基因食品的管理，歐盟、日本、加拿大都已制定了對轉基因食品進行標簽標識管理的法規，歐盟(EC)49/2000號條例規定食品中含有超過1％的轉基因成分時，必須在標簽上做出標識。

為了加強對農業轉基因生物的安全管理，保障人體健康，規范轉基因產品的銷售行為，引導和保護消費者的知情權，2002年中國農業部頒布了《農業轉基因生物標識管理辦法》，2006年通過了《中華人民共和國農產品質量安全法》，明確規定在中國境內銷售列入標識的轉基因生物及其產品，必須進行是否含有轉基因成分的標識。因此，建立針對轉Bt基因作物快速檢測方法具有十分重要的現實意義。

目前國際上，對轉基因農產品采取的主要檢測方法是建立在核酸水平上的PCR檢測，包括競爭PCR(competitive?PCR)、實時定量PCR(real-time?PCR)、PCR-ELISA方法；建立在蛋白質水平上的Western印記、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和免疫試紙條的檢測方法。由于這些方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；不適合于現場實時檢測和跟蹤檢測；檢測成本過高；對檢驗人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高等不足之處，方法較難普及。

Notomi等在2000年首次報道一種新的DNA擴增方法即DNA環介導等溫擴增法

(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)。LAMP法不需要常規PCR必需的反復升溫解鏈過程，可在60～65℃恒溫條件下持續擴增，擴增效率高，幾十分鐘可達10⁹～10¹⁰個拷貝，因此不需特殊設備，檢測時間更短、敏感性更高；同時6條特異性引物識別靶基因的8個特定區域，特異性更高，因此在轉基因檢測上明顯優于PCR。

本發明首次基于Bt基因序列和核酸試紙條建立LAMP技術應用于轉Bt基因作物的檢測，提供了針對轉Bt基因作物的Bt引物序列、試劑盒和檢測方法。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測轉Bt基因作物的核苷酸序列。

本發明的另一個目的是提供快速、準確、便于結果判定，易于控制污染的檢測轉Bt基因作物的檢測試劑盒(基于核酸試紙條)。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

選擇Bt基因特定保守序列作為靶區域，在多重序列比對的基礎上，進行引物設計。

一組檢測轉Bt基因作物的核苷酸序列，如下：

1)5’-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3’(SEQ?ID?NO：1)

2)5’-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3’(SEQ?ID?NO：2)

3)5’-GAATACGCATTTCCTCGCTTAGAGAGCTTCAGAGAGTGG-3’(SEQ?ID?NO：3)

4)5’-CTAATCTTCACCTCAGCGTGTTCTATTGATGGTTGCAGCATC-3’(SEQ?ID?NO：4)