[發(fā)明專利]一種同步檢測多種煙草病毒的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010232750.3
• 申請日: 2010-07-21
• 公開（公告）號: CN101875982A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成巨龍;吳云鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西省煙草研究所;西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京億騰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11309
• 代理人: 陳惠蓮

1.一種同步檢測2-5種煙草病毒的方法，該方法包括煙草病毒總RNA的提取，多重RT-PCR和電泳檢測確定病毒種類，其中煙草病毒選自煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、煙草蝕紋病毒(TEV)和煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)中的2-5種，其中多重RT-PCR反應(yīng)中應(yīng)用的引物為包含如下5對引物中的2-5對引物的引物組：

第1對引物：

SEQ?ID?NO.1：5′-TAGACCCGCTAGTCACAG-3′

SEQ?ID?NO.2：5′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′

第2對引物：

SEQ?ID?NO.3：5′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′

SEQ?ID?NO.4：5′-GTGGGAATGCGTTGGT-3′

第3對引物：

SEQ?ID?NO.5：5′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′

SEQ?ID?NO.6：5′-GTGCCGTTCAGTGTCTT-3′

第4對引物：

SEQ?ID?NO.7：5′-CCGAGAATCAAGGCTATC-3′

SEQ?ID?NO.8：5′-CGCTAAACCTACATCCC-3′

第5對引物：

SEQ?ID?NO.9：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′

SEQ?ID?NO.10：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中引物組中包含5對引物SEQ?IDNO.1-10。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括如下步驟：

1)病毒總RNA的提取：

提取感染2-5種病毒的煙草葉中的病毒總RNA；

2)多重RT-PCR：

應(yīng)用SEQ?ID?NO.2、4、6、8、10(第1-5對引物中反向引物序列)對病毒總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA模板，然后應(yīng)用SEQ?ID?NO.1-10(第1-5對引物中的正向和反向序列)對cDNA模板進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，得擴增產(chǎn)物；

3)電泳檢測：

對擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得病毒基因擴增產(chǎn)物條帶，判定煙草病毒種類。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中五對引物濃度比例為第1對引物∶第2對引物∶第3對引物∶第4對引物∶第5對引物＝1.2-1.6∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶0.8-1.2∶1.3-1.7。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中五對引物濃度比例為第1對引物∶第2對引物∶第3對引物∶第4對引物∶第5對引物＝1.4∶1∶1∶1∶1.5。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中dNTPs濃度為0.12-0.32mmol/L；Taq?DNA聚合酶濃度為0.02-0.12U/μL；Mg²⁺濃度為1.2-3.2mmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中dNTPs濃度為0.28mmol/L，Taq?DNA聚合酶濃度為0.10U/μL，MG²⁺濃度為2.4mmol/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中，退火溫度為48-51℃，延伸時間為60s-90s，循環(huán)次數(shù)為3045次。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中多重PCR反應(yīng)中，擴增條件為退火溫度51℃，延伸時間60s，循環(huán)次數(shù)35次。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中病毒總RNA的提取過程中，采用BIOzol試劑盒提取總RNA。