[發(fā)明專利]一種在真菌中表達鑒定外源基因的方法

無效

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• 申請日: 2010-07-16
• 公開（公告）號: CN101914567A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 徐榮旗;陸偉;張維;林敏
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/54;C12Q1/68
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 馬明恥

技術領域：

本發(fā)明涉及一種植物轉基因育種方法，具體涉及一種利用CaMV?35S啟動子在真菌中表達外源基因，快速鑒定基因功能的方法。

背景技術：

在現(xiàn)有技術的植物轉基因育種方法中，待轉入的外源基因通常需要首先在真核生物中進行表達和功能驗證，再導入目標植物中。目前常用的方法是：通過轉化模式植物，如煙草或擬南芥，檢測其表達情況及初步功能，再將該基因轉到目標植物中。這個過程鑒定周期較長，一般需要6-8個月才能完成，并且費時、費力。

真菌是最簡單的真核生物。與轉化植物相比，真菌的遺傳轉化省去了播種、收獲、組織培養(yǎng)等繁瑣的操作過程，并且周期短，操作簡便易行。因此，如果能夠在真菌中實現(xiàn)外源基因的表達和功能初步鑒定，將大大縮短轉基因育種進程。用作真菌轉化的方法很多，但目前公認的方法是通過農桿菌介導(侵染)的轉化。實現(xiàn)轉化過程已經是成熟的技術，通過農桿菌轉化真菌和轉化植物的原理基本相同。

目前，用于高等植物遺傳轉化的表達載體，其標記基因和功能基因所使用的啟動子均為CaMV35S啟動子。CaMV35S是來自花椰菜病毒的一種強啟動子，可以被植物識別，被廣泛應用于植物轉基因育種中。但是，遺憾的是，多數(shù)真菌對其無法識別，如果將植物表達載體轉入真菌，則會導致其所帶有的抗性標記基因和功能基因無法在真菌中表達。所以，當科學家從原核生物(如細菌)中獲得一個有用的基因后，必需先在擬南芥這樣的模式植物中去做初步表達和功能鑒定，然后再轉入需要的植物中，因為擬南芥的遺傳轉化非常容易、方便(植物轉化比較難，主要難在組織培養(yǎng)成苗過程)，然而，就是這個目前被認為最方便快捷的過程也需要半年以上。因此，在真核生物中建立一個更加快速、簡便易行的外源基因表達鑒定方法很有必要。

有人發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌可以識別CaMV35S啟動子，現(xiàn)有技術中，尚未見有人將其用于在真菌中對外源基因的表達和功能鑒定。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的最終目的是建立一種能夠快速、省時、省力地在真菌中對來自原核生物的新的功能基因進行表達和功能鑒定的方法。

本發(fā)明的直接目的是利用農桿菌介導和CAMV35S啟動子表達外源基因和進行功能初步鑒定。

為了解決絕大部分真菌不識別植物表達載體所用的CAMV35S啟動子的問題，本發(fā)明人對尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)可以識別CaMV35S啟動子進行了研究。利用了這個特點，本發(fā)明實現(xiàn)了在真菌中快速對外源基因進行表達鑒定的目的。

尖孢鐮刀菌屬于半知菌亞門、鐮刀菌屬。有人發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌可以識別CAMV35S啟動子。本發(fā)明實驗證明，常用的植物表達載體pCAMBIA1300可以直接轉化尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)獲得具有潮霉素抗性的突變體，表明尖刀鐮孢菌的確可以識別植物表達載體潮霉素磷酸轉移酶基因帶有的CaMV35S啟動子。這是迄今為止報道的唯一一個可以識別CaMV35S啟動子的絲狀真菌，這一發(fā)現(xiàn)使目前適用于植物轉化的雙元載體不需要任何修改就可以用來轉化真菌。

本發(fā)明方法的技術手段是：

利用CaMV35S啟動子在真菌中進行基因表達和鑒定的方法，其操作步驟如下：

1、將目的基因克隆至帶有CaMV35S啟動子的植物表達載體上；

2、將步驟1所得的載體轉化導入農桿菌中；

3、用步驟2所得到的農桿菌侵染尖孢鐮刀菌，篩選獲得陽性轉化子；

4、對步驟3所述陽性轉化子中含有的目的基因進行表達和初步功能鑒定。

上述步驟1中，所述植物表達載體可以是本領域常用的植物表達載體，如pBI121或pCAMBIA系列等；

步驟3中，可以選用潮霉素抗性為篩選標記。

在運用本方法的一個實例中，發(fā)明人構建了高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表達載體，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法，轉化尖孢鐮刀菌EPSPs基因敲除的突變體，可以使其恢復對草甘膦的耐受性。發(fā)明人從原核生物中獲得了一個新型高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因，采用本發(fā)明提供的方法快速對該基因在真核生物中進行了表達和功能快速鑒定。主要操作步驟如下：

1、將EPSP合酶基因的開放閱讀框序列5′端連接CAMV35S啟動子，3′端連接nos終止子；

2、將連接好的完整的EPSP合酶基因克隆至pCAMBIA1300的多克隆位點(圖1)；

3、得到的重組質粒(表達載體)轉化導入農桿菌AGL-1中；