[發明專利]一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白及其應用

無效

• 申請號: 201010230986.3
• 申請日: 2010-07-20
• 公開（公告）號: CN101914563A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 張娟;蔣俊;董亞俊;吳雪瓊
• 申請（專利權）人: 沈陽市胸科醫院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;C07K19/00;C07K16/12;G01N33/543;G01N33/569;A61K39/04;A61P31/06;C12R1/19
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種結核分枝桿菌重組融合蛋白及其應用。

背景技術

結核病是由結核分支桿菌(Mycobacterium?tuberculosis，TB)感染所致的人類疾病，是分支桿菌病的主要類型，主要通過呼吸道傳播。自1882年德國科學家Rrobert?Koch發現TB以來，全球約有兩億人死于TB，且疫情發展日趨嚴重。據WHO預計，全球現有TB病人2000萬，如不控制今后10年還將有9000萬人發病。我國現有3.3億結核菌感染者，肺結核病人600多萬，其中有嚴重傳染性的病人150萬，每年死于結核病的達25萬人。因此，結核病的預防、早期診斷和及時治療是高度關注的課題。MTB有H37Rv與H37Ra兩種標準菌株，前者為毒力株而后者為減毒突變株，它們均來源于1934年的人肺H37分離株。與一些臨床分離株不同的是，H37Rv對藥物敏感、利于基因工程操作并在TB動物模型中保留了完整毒力，因而該菌株被廣泛應用于TB相關的生物醫藥研究(MTb?H37Rv?project?at?Sanger?Institute，NCBI)。目前常用的結核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查(AFP)和培養法，以及分子生物學和血清學檢查，這些方法多基于高特異性的抗原建立。

本發明提供了一種用基因工程方法生產的結核重組融合蛋白作為抗原，與常用抗原相比特異性更強，用其作為抗原制備的免疫診斷試劑盒，可為結核病感染的檢測提供更為特異、準確的工具。

發明內容

(一)要解決的技術問題

本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌重組融合蛋白，并提供該結核分枝桿菌重組融合蛋白在制備單抗、多抗、檢測試劑盒、蛋白芯片和疫苗中的應用。

(二)技術方案

本發明提供了一種編碼結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發明還提供了一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白，該重組融合蛋白由所述融合基因編碼，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。

本發明提供了一種結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的表達載體，該表達載體是將所述融合基因插入到質粒pET-28b上得到的重組質粒pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其質粒圖譜如附圖1所示。

本發明又提供了一種表達結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的工程菌株，該工程菌株含有表達載體pET-28b-38Kd-16Kd-CFP10，其宿主菌為大腸桿菌(Escherichia?coli)。

本發明還提供了一種結核分枝桿菌抗體IgG酶聯免疫檢測試劑盒，它包括前述的38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白和酶標二抗。所述38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白的包被量為2.0μg/孔，酶標二抗工作濃度為4.0mg/mL。

本發明提供了一種結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒，它包括TB抗原、膠體金標記TB抗原和質控線包被兔抗TB抗體，其中所述TB抗原和膠體金標記TB抗原均是由前述的結核分枝桿菌38Kd-16Kd-CFP10重組融合蛋白制得。

本發明所述的結核分枝桿菌抗體IgG診斷試劑盒，TB抗原噴點濃度為0.25-2.0mg/mL，膠體金標記TB抗原染色液的工作濃度為OD值50.0-100.0，TB抗原噴點量為0.5-1.75μL/cm，膠體金標記TB抗原噴點量為0.5-1.75μL/cm，質控線包被兔抗TB抗體包被濃度為0.5-2.0mg/mL，反應膜封閉時間為45-75分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度25％-30％下干燥30-75分鐘，膠體金標記TB抗原墊干燥條件為相對濕度25％-30％下干燥3-5小時，標本檢測反應時間為15℃～30℃下反應10-30分鐘，溫度低于15℃時標本檢測反應時間為40-50分鐘。

優選地，TB抗原噴點濃度為1.0mg/mL，膠體金標記TB抗原染色液的工作濃度為OD值80.0，TB抗原噴點量為1.0μL/cm，膠體金標記TB抗原噴點量為1.0μL/cm，質控線包被兔抗TB抗體包被濃度為1.0mg/mL，反應膜封閉時間為60分鐘，反應膜干燥條件為相對濕度25％-30％下干燥60分鐘，膠體金標記TB抗原墊干燥條件為相對濕度25％-30％下干燥4小時，標本檢測反應時間為15℃～30℃下反應25-30分鐘。