[發明專利]農桿菌介導法生產大型叢生竹類的方法

無效

• 申請號: 201010230013.X
• 申請日: 2010-07-19
• 公開（公告）號: CN101906434A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 胡尚連;曹穎;李曉瑞;段寧;盧學琴;任鵬
• 申請（專利權）人: 胡尚連
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及利用轉基因方法生產叢生竹類，尤其是利用農桿菌介導法生產大型叢生竹類的方法，屬于植物轉基因技術領域。

背景技術

目前，竹類基因克隆及其遺傳改良方面的研究尚處起步和探索階段。在基因克隆方面，盡管相繼在慈竹、綠竹、毛竹上克隆了調控竹木質素相關合成酶基因，但未見在工業紙漿用竹中成功進行遺傳轉化的研究報道。原因是還未建立大型工業紙漿用竹遺傳轉化體系，制約了相關基因表達與調控的研究及其在竹遺傳改良方面的應用。

發明內容

針對上述問題，本發明提供一種農桿菌介導法生產大型叢生竹類的方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：農桿菌介導法生產大型叢生竹類的方法，包括如下步驟：

a.愈傷組織誘導：取竹種子成熟胚置于愈傷組織誘導培養基MS2上培養2-3周后，獲得愈傷組織，3-4周后，獲得竹胚性愈傷組織；

b.預培養：將處于誘導后期的竹胚性愈傷組織轉接至新鮮的愈傷組織誘導培養基MS2中預培養1周；

c.含有目的基因農桿菌的活化與重懸：挑取含有目的質粒的農桿菌，在含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農桿菌培養基YEB上劃線，在28℃培養箱中培養兩天；挑取單菌落于另一新鮮的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農桿菌培養基YEB上繼續培養兩天；在超凈臺中刮取農桿菌培養基YEB平板上的農桿菌于誘導液中重懸混勻，使OD600接近0.2；

d.侵染和共培養：取經過預培養的竹胚性愈傷組織于誘導液中振蕩30min，取出竹胚性愈傷組織，在無菌濾紙上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培養培養基上共培養兩天；

e.篩選抗性愈傷組織：取出竹胚性愈傷組織轉接至含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的抗性篩選培養基上篩選抗性愈傷組織；

f.叢生芽分化和伸長：將篩選到的抗性愈傷組織轉入叢生芽分化培養基，誘導叢生芽；

g.伸長叢生芽根的誘導：取健壯叢生芽幼苗直接轉入生根培養基生根；幼苗在生根培養基中生長15-20天，誘導生根，獲得再生小植株；

h.轉化植株鑒定：用PCR方法對上述獲得的再生小植株進行檢測，確定外源基因已經整合到竹子基因組DNA中，確定轉化小植株；

i.幼苗移栽：將上述轉化小植株洗凈培養基，移入營養缽中，利用人工噴水保持環境濕度，經過馴化煉苗20-30天后，移栽入裝有花園土、直徑為30cm的花盆中。

所述的步驟a、b中，

愈傷組織誘導培養基MS2的配方為：MS+2，4-D?2mg/L+KT0.2mg/L+IBA0.4mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟c中，

農桿菌培養基YEB的配方為：細菌蛋白胨5g/L，酵母浸膏1g/L，牛肉浸膏5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.04g/L，瓊脂16g/L，pH7.0；

誘導液為：MS2，麥芽糖30g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟d中，

誘導液為：MS2，麥芽糖30g/L，pH5.6-5.8；

共培養培養基的配方為：MS2，乙酰丁香酮14.7mg/L，麥芽糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟e中，

抗性篩選培養基的配方為：MS2，卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟f中，

叢生芽分化培養基的配方為：MS+KT2.5mg/L+IAA?0.5mg/L，卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟g中，

生根培養基的配方為：MS+NAA0.25mg/L+IBA?0.4mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂5g/L，pH5.6-5.8；

所述的步驟i中，

營養缽中的配方為：腐葉土∶石英砂∶土壤＝2∶1∶1；

培養條件為：晝溫度25℃，夜溫度18℃，光照時間14h/d。