[發(fā)明專利]松材線蟲快速檢測(cè)方法及試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010228975.1
• 申請(qǐng)日: 2010-07-16
• 公開（公告）號(hào): CN101921844A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬新穎;徐志宏;陳為民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江農(nóng)林大學(xué);杭州市森林和野生動(dòng)物保護(hù)管理總站
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種松材線蟲快速檢測(cè)試劑盒，包括特異性引物、DNA提取液、松材線蟲陽(yáng)性DNA及PCR反應(yīng)用液，其特征是：

1)松材線蟲特異性引物序列：

SCXC-F：5’-AAAATAAATGTAAAATGAATG-3’；

SCXC-R：5’-GTGCTCGTCACGATGATG-3’；

2)線蟲DNA提取液中各原料及其濃度是：

200mmol/L?Tris-HCl、200mmol/L?NaCl、100mmol/L?EDTA、20mg/mL?SDS、20μL/mLβ-巰基乙醇和200μg/mL蛋白酶K；

3)PCR反應(yīng)用液為：

10×PCR緩沖液、10mM?dNTP、20μM?SCXC-F、20μM?SCXC-R、5U/μL?Taq?DNA聚合酶、松材線蟲陽(yáng)性DNA和重蒸水。

2.用權(quán)利要求1所述松材線蟲快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)松材線蟲的方法，其特征是包括如下步驟：

1)線蟲DNA的提取

取收集的線蟲200μL置于Eppendorf管中，加入300μL線蟲DNA提取液，混勻，在65℃水浴中處理1h，每隔10min搖動(dòng)一次；用氯仿與異戊醇的體積比為24∶1的混合液500μL抽提，4℃條件下，12000r/min離心15min，取上清液；在上清液中加入2倍于上清液體積的無(wú)水乙醇，-20℃條件下放置30min，12000r/min離心10min；沉淀物用-20℃預(yù)冷的75％乙醇1mL洗滌1次，沉淀物干燥后加入100μL滅菌重蒸水重新懸浮沉淀即為PCR擴(kuò)增的模板DNA，在-20℃中冷藏備用；

2)PCR反應(yīng)體系的制備

取一0.5mL?PCR薄壁管，依次加入以下試劑及其含量：

10×PCR緩沖液????????????2.5μL

dNTP混合物，10mmol/L?????0.5μL

SCXC-F，20μmol/L????????0.5μL

SCXC-R，20μmo?l/L???????0.5μL

Taq?DNA聚合酶，5U/μL????0.5μL

模板DNA??????????????????2μL

加重蒸水至終體積為25μL，將離心管在離心機(jī)中快速離心使PCR反應(yīng)液混勻；

3)PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置

94℃預(yù)變性5分鐘后開始以下循環(huán)反應(yīng)：

94℃變性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸10分鐘；

4)PCR反應(yīng)結(jié)果的電泳檢測(cè)：

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物加2μL?6×DNA上樣緩沖液，以含溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，與對(duì)照DNA的擴(kuò)增進(jìn)行比較，如果在270bp處有條帶，說(shuō)明該樣品為松材線蟲，沒有條帶，說(shuō)明不是松材線蟲。