[發明專利]鏈親和素/sCD40L融合蛋白

無效

• 申請號: 201010228717.3
• 申請日: 2010-07-08
• 公開（公告）號: CN101935353A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 高基民;張振;李金龍;許曉玲
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A61K39/00;A61P35/00
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技術領域

本發明涉及基因工程和蛋白質工程領域，具體涉及來源于動物的多肽，特別是CD40配體。

背景技術

CD40L/CD40在細胞和體液免疫中都發揮重要作用。作為免疫細胞激活的共刺激分子，CD40L參與機體抗腫瘤的免疫應答。CD40配體(CD40?ligand，CD40L)又稱CD154，屬于腫瘤壞死因子超家族成員的II型跨膜糖蛋白，主要表達于CD4+T細胞，激活的B細胞和血小板也表達一部份，可與B細胞表面CD40結合。其結果，一方面刺激B細胞分泌IL-4，后者與IL-R結合誘導B細胞表達B7-1/B7-2；另一方面直接誘導B7-1/B7-2表達。B7-1/B7-2與T細胞表面的CD28/CTLA-24分子結合，對T細胞活化提供第二信號。另外，CD40L也可以通過促進DC細胞的成熟和分泌多種細胞因子從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。很多腫瘤細胞表面表達CD40，通過與CD40的結合，可以直接抑制腫瘤細胞的生長，促進其凋亡。因此，CD40L具有抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用。CD40L基因用來修飾腫瘤細胞，制備腫瘤細胞疫苗，以增強腫瘤抗原的免疫原性。通過原位基因轉染(或轉導)在腫瘤病灶局部實現CD40L持續有效表達的治療策略，已在表淺膀胱癌的臨床前研究中顯示出誘人的前景。但是，用基因修飾法制備腫瘤細胞疫苗存在如下固有缺陷：修飾效率一般都較低(尤其是原位基因轉染或轉導)，并取決于腫瘤細胞類型；因影響因素較多，致使治療基因的蛋白質表達產物的有效濃度在局部難于達到并較長時間地維持，從而實際抗腫瘤的臨床效果非常有限；因個體差異和獲得腫瘤標本時腫瘤細胞的成活狀態不一致，往往有些病人因無法提供成活狀態較好的腫瘤細胞，最終不能制成自體腫瘤細胞疫苗；往往有潛在的病毒載體安全性問題(所謂“遺傳毒性”)和免疫原性問題(反復使用同一病毒載體會影響導入基因的表達效率)；很難同時高效表達多個具有協同作用的免疫刺激因子，并對它們的表達量進行精確控制。此外，基因修飾的自體腫瘤細胞疫苗制備比較費時，不易大規模開展和廣泛使用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種可以對腫瘤細胞進行快速表面修飾并能夠永久地錨定在腫瘤細胞表面的新型CD40L。

本發明解決上述技術問題的技術方案是：

一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接鏈親和素和CD40L構成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Thr?Ser?Gly?Gly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser?Gly?Gly?Gly?Gly?Ser?Gly?Glu?Phe。

本發明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端；本發明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、CD40L基因以及連接所述的鏈親和素和CD40L的接頭多核苷酸通過基因重組、轉化構建工程菌表達獲得，其中基因重組和轉化的方法均為本領域普通技術人員所熟識的技術。

為了便于融合蛋白的分離純化，本發明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連接有純化標簽，本發明融合蛋鏈親和素的N端連有組氨酸標簽。

本發明還提供一種編碼本發明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素cDNA、可溶CD40L?cDNA通過ACG?AGC?GGG?GGC?AGC?GGG?GGC?GGA?GGC?AGC?GGC?GGGGGC?GGA?TCC?GGC?GAA?TCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CAT?CAT?CAC?CAT?CAC?CAT。

將所述的編碼本發明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組插入到原核表達載體中，然后轉化大腸桿菌可獲得高效表達本發明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達載體是pET24a，大腸桿菌為BL21(DE3)。

本發明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并復性處理后，即可獲得本發明融合蛋白。

本發明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接CD40L和鏈親和素，此18肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質分子的獨立折疊，從而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有鏈親和素和CD40L的雙重活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結合將CD40L錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ射線滅活腫瘤細胞表面穩定存在，并仍保持CD40L的活性。

本發明融合蛋白具有雙功能，一方面可以錨定于生物素化的組織局部發揮抗腫瘤作用，另一方面可以將融合蛋白錨定于生物素化的滅活腫瘤細胞表面制備CD40L膜修飾的腫瘤疫苗可用于制備預防性和治療性腫瘤的疫苗。本發明所述的腫瘤疫苗是將本發明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細胞表面獲得的。