[發(fā)明專利]利用根特異啟動(dòng)子與抗病基因培育煙草抗青枯病品系方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010227467.1
• 申請(qǐng)日: 2010-07-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101880673A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 莊偉建;陳順輝;蔡鐵城;潘建箐;閆利明;蘭嵐;陳華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種運(yùn)用基因工程技術(shù)培育煙草安全抗青枯病種質(zhì)材料的方法，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

煙草青枯病是我國(guó)南方煙草種植過(guò)程中的重要病害，利用傳統(tǒng)的防治手段，長(zhǎng)期以來(lái)未能得到有效的解決，給煙草的產(chǎn)量和煙葉的品質(zhì)帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。煙草青枯病導(dǎo)致煙株死亡的原因很多，近年來(lái)的生物化學(xué)和基因研究表明，胞外多糖（EPS，由eps基因編碼）以及降解植物細(xì)胞壁的纖維素酶（主要為內(nèi)切葡萄糖酶EG，由egl基因編碼）和果膠酶（主要是內(nèi)聚半乳糖醛酸酶PG，由pglA基因編碼）是病菌在維管束中群居、蔓延以及植物細(xì)胞壞死和溶菌作用所必須的因子（SealSE，etal.1999）。研究還表明，青枯病菌在導(dǎo)管中生長(zhǎng)時(shí)可產(chǎn)生大量的胞外多糖，影響和阻塞植物體內(nèi)水分運(yùn)輸，特別是易于對(duì)葉柄和小葉處較小孔徑的導(dǎo)管孔板造成堵塞而引起植株萎蔫；同時(shí)，青枯病菌還分泌細(xì)胞外多種細(xì)胞壁降解酶（如纖維素酶類和果膠酶類），其可能也在破壞導(dǎo)管組織，引起植株枯萎死亡方面起重要作用（何禮遠(yuǎn)和康耀衛(wèi)，1995）

煙草青枯病是一種細(xì)菌性侵染病，是典型的維管束病害，根、莖、葉都可受害。煙草青枯病最典型的癥狀是枯萎：發(fā)病初期，在晴天中午可見(jiàn)煙株的一側(cè)1至2片葉片凋萎下垂，而夜間可以恢復(fù)，萎蔫一側(cè)的莖上有褪綠條斑，萎蔫葉片仍為青色，故稱“青枯”。發(fā)病中前期，煙株一直表現(xiàn)為一側(cè)葉片枯萎，另一側(cè)葉片比較正常，這時(shí)拔出根部，可見(jiàn)發(fā)病一側(cè)的許多側(cè)根變黑腐爛，但另一側(cè)比較正常。隨著病情的進(jìn)一步加重，褪綠條斑變?yōu)楹谏珬l斑，可達(dá)到煙株頂部，發(fā)病中期枯萎的葉片由綠色變淺綠，然后逐漸變黃，大部分葉片萎蔫。有條斑的莖和根部全部變黑。到發(fā)病后期，全部煙葉萎蔫變黃，根部全部變黑腐爛，直至整株死亡。擠壓橫切莖部有黃白色的乳狀粘液即菌膿溢出。

煙草是四倍體，遺傳背景及其復(fù)雜，主要栽培品種大多數(shù)是已經(jīng)種植十幾年了，因此容易受到青枯病的危害，且目前尚未特效藥劑能夠防治，因此只能通過(guò)選育出新品種才能有效的抵制青枯病，而傳統(tǒng)育種的育種年很長(zhǎng)，且煙草是一種特殊的產(chǎn)品，因此不能滿足煙草生產(chǎn)的需要。自從1986年，美國(guó)Powel-Abel最先報(bào)道了將TWV-CP基因轉(zhuǎn)入煙草獲得了對(duì)TMV既有抗性的轉(zhuǎn)CP基因煙草植株以來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成功運(yùn)用于煙草的分子育種與功能基因鑒定方面。國(guó)內(nèi)科研工作者已成功將TMV、CMV、馬鈴薯X病毒與Y病毒（PVX與PVY）等病毒的的CP基因、復(fù)制酶基因?qū)霟煵荩@得相應(yīng)的抗植物病毒的轉(zhuǎn)基因植株（方榮祥等，1990；1993；周汝鴻等，1994；吳中心等，1994；王振東等，1995；項(xiàng)瑜等，1995；吳元華等，1997；朱小平等，1998；魏振承和FosterG，2000）。RIP具有廣譜的抗病毒活性，已成為抗病毒病的研究熱點(diǎn)。分子量約為30kDa的商陸抗病毒蛋白（Pokeweedactiviralprotein，PAP）屬I(mǎi)型堿性核糖體失活蛋白，對(duì)TMV、CMV、AMV、PVX、PVY等病毒都具有一定的抑制作用（IrvinJD，1975）。1993年成功導(dǎo)入煙草即表現(xiàn)出對(duì)植物病毒的抗性，對(duì)機(jī)械傳播和蚜蟲(chóng)傳播的多種病毒均有效。這是第一次RIP基因在植物抗病毒基因工程中發(fā)揮作用，但RIP基因在抗煙草細(xì)菌性病害上尚無(wú)報(bào)導(dǎo)，PAP在煙草中適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)可保護(hù)其不受病毒的侵害，但高水平表達(dá)對(duì)煙草本身也產(chǎn)生毒害（LodgeJK，etal.1993）。特異啟動(dòng)子能夠定時(shí)定量讓基因表達(dá)，因此用特異啟動(dòng)子攜帶抗病基因在植物里面表達(dá)能在一定程度上解決基因本身給植物帶來(lái)的影響。

本發(fā)明就是針對(duì)以上背景技術(shù)，通過(guò)分離克隆RIP基因，與煙草根特異啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子、目的基因連接在載體上，構(gòu)建植物表達(dá)載體，建立以抗生素為篩選劑的轉(zhuǎn)基因遺傳體系，以及快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)和接種抗病鑒定，大幅度的提高煙草抗青枯病能力，為解決煙草安全抗青枯病品種的培養(yǎng)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用煙草根特異啟動(dòng)子、抗病基因RIP培育抗青枯病煙草新品系的方法。所解決的技術(shù)問(wèn)題是一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全有效的解決煙草青枯病的方法。