[發明專利]同時檢測兩種蘭花病毒的二溫式多重RT-PCR試劑盒與制備方法

無效

• 申請號: 201010225728.6
• 申請日: 2010-07-09
• 公開（公告）號: CN101871019A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 鄭國華;明艷林;陳良華;鄭志忠;吳美愛;童慶宣
• 申請（專利權）人: 廈門華僑亞熱帶植物引種園
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及一種植物病毒檢測試劑盒，尤其是涉及一種同時檢測兩種蘭花病毒的二溫式多重RT-PCR試劑盒與制備方法。

背景技術

蘭花病毒多達20多種，其中以建蘭花葉病毒(Cymbidium?mosaic?virus，CyMV)和齒蘭環斑病毒(Odontoglossum?ringspot?virus，ORSV)最為普遍，危害最嚴重。由于蘭花病毒無法使用藥劑進行防治，因此如何盡早檢測蘭花病毒，剔除帶病蘭花，成為目前最主要的防治途徑。

公開號為CN1975427、CN1975428、CN1975425、CN1975426、CN101294962的中國專利申請分別采用斑點酶聯、雙抗夾心酶聯和膠體金試紙條等血清學技術建立建蘭花葉病毒和齒蘭環斑病毒檢測技術；但是涉及的檢測技術無法克服血清學檢測方法的缺陷，存在靈敏度低和大量假陰性樣品無法檢出等缺點；僅僅能夠滿足日常生產檢測需要，對于病毒含量較低的樣品，難于有效進行檢測。因此在蘭花生產過程中采用以上發明的檢測技術只能夠對發病前的樣品進行檢測、篩選，對于病毒的防治僅僅是治標，無法從根本上解決病毒問題。

只有通過高靈敏度的病毒檢測技術篩選真正無毒的植株作為母本進行種苗的生產，才能從根本上解決病毒的問題。目前，有關高靈敏度病毒檢測方法，最為成熟的技術就是RT-PCR檢測方法，該方法能夠檢測的最低病毒濃度為500Copies/mL，相當于每毫升樣品液含2fg病毒，檢測靈敏度達到血清學技術的10⁶倍。因此該方法是目前最為可靠的病毒檢測技術，能夠滿足無毒擴繁母株的篩選，從而生產無毒種苗，從根本上解決病毒的危害問題。但是由于該方法檢測成本非常高，按每個樣品檢測兩種病毒進行兩次RT-PCR的話，就需要1000元人民幣檢測費用，非常昂貴。再加上由于現在病毒泛濫，通常都需要通過檢測10份以上的樣品，才有機會得到一株無毒母株。由于企業無法承擔高昂的成本種苗，因此最終只能通過繼續生產普通種苗充斥蘭花產業，造成惡性循環。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的病毒檢測技術存在靈敏度低、需要分次檢測、費用較高等問題，提供一種能夠在一次檢測過程中同時檢測兩種蘭花病毒的二溫式多重RT-PCR試劑盒及其使用方法。

所述同時檢測兩種蘭花病毒的二溫式多重RT-PCR試劑盒由以下試劑組成：

試劑A：RT反應液，含有M-MuLV逆轉錄酶緩沖液、隨機引物、dNTP。

試劑B：M-MuLV逆轉錄酶。

試劑C：PCR反應液，含有PCR緩沖液、MgCl₂、dNTP、檢測引物。

試劑D：Taq聚合酶。

試劑E：對照品。

所述5XM-MuLV逆轉錄酶緩沖液為5～10μL，所述隨機引物(0.1uM)為1～2μL，所述dNTP(10mM)為0.5～1μL。

所述PCR緩沖液為2.5～5μL，所述MgCl₂(25mM)為2.5～5μL，所述dNTP(10mM)為0.5～1μL，所述檢測引物(0.1uM)為1～2μL；所述檢測引物的序列如下：

CyMV上游引物：5′-GCTACCGCCGCCATCGTCAT-3′

CyMV下游引物：5′-GCGCAGCACGTTCACGGTCA-3′

ORSV上游引物：5′-CCACCGAACTTACTGAAGCA-3′

ORSV下游引物：5′-TGTCGTAAGGTTGACCACTC-3′。

所述對照品分為陽性對照和陰性對照，陽性對照為帶有兩種病毒的凍干蘭花葉片粉末，陰性對照為無兩種病毒的凍干蘭花葉片粉末。

所述兩種蘭花病毒為建蘭花葉病毒(Cymbidium?mosaic?virus，CyMV)和齒蘭環斑病毒(Odontoglossum?ringspot?virus，ORSV)。

所述同時檢測兩種蘭花病毒的二溫式多重RT-PCR試劑盒的使用方法如下：

每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。

1)逆轉錄：即cDNA合成。總體積25μL，RNA經94℃預變性5min后置于冰浴中待測，取RNA?1μL、試劑A?23.5μL、試劑B?0.5μL。于37℃水浴反應1小時合成cDNA。

2)擴增檢測：總體積25μL，其中cDNA?1μL，同時檢測兩種病毒的PCR反應液23.5μL、試劑D?0.5μL。

3)取反應產物5μL按常規瓊脂糖凝膠電泳測定擴增條帶大小。