[發明專利]針對混合、微量檢材進行個體識別的方法

無效

• 申請號: 201010225344.4
• 申請日: 2010-07-05
• 公開（公告）號: CN102311992A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 胡蘭;李彩霞
• 申請（專利權）人: 公安部物證鑒定中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 劉芳

1.一種針對混合、微量檢材進行個體識別的方法，其特征在于，包括：

利用顯微操作法捕獲檢材細胞的單個細胞；

利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型；

對擴增分型后的產物進行檢測，以進行個體識別。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述顯微操作法包括顯微操作儀捕獲法或激光顯微切割法。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢材細胞為口腔上皮細胞。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，利用顯微操作儀捕獲法捕獲檢材細胞的單個細胞包括：

將含口腔上皮細胞的檢材放入含有1mL?TNE的1.5mL?Eppendorf離心管中，使其上的細胞充分脫落；振蕩離心管，使溶液中的細胞盡量離散開；

將滅菌后的載玻片置于顯微鏡載物臺上，吸取30μL細胞懸液滴加到載玻片上，并用槍頭使懸液展平，靜置2分鐘，讓細胞充分沉降到載玻片表面，在4×10倍鏡下調整顯微操作儀吸針進入細胞懸液并位于視野中央，然后在10×10倍鏡下微調吸針，使之接近分散良好、膜完整而輪廓清晰的上皮細胞；通過調整油泵的吸吐旋鈕，在捕獲細胞的同時進行計數；將吸針抬離液面，獲得捕獲出的單細胞；重復如上步驟，獲得多個單細胞。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型包括：

利用所述低體積擴增系統，以及STR?Identifiler或STR?MiniFiler熒光標記復合擴增試劑盒對所述單個細胞的DNA進行擴增分型。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型具體包括：

把捕獲的細胞置于低體積擴增反應玻片上，加入0.4mg/mL的蛋白酶K?0.75μL，5μL封閉液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加樣尖穿過封閉液再加入0.75μL?Master?mix，按照所述STR?Identifiler試劑盒或所述STRMinifiler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增分型。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢材細胞為精子細胞。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，利用顯微操作儀捕獲法捕獲檢材細胞的單個細胞包括：

剪取適量精斑檢材，剪碎后放入1.5mL?Eppendorf離心管中，加一定量的TE至能淹沒檢材為準，再加入SDS和PK使其終濃度為1wt％和0.1mg/mL，56℃浸泡2h以上，期間用消毒鑷翻轉擠壓載體使精子細胞最大限度地從檢材上洗脫下來；漩渦震蕩后套管離心去除檢材，棄上清，沉淀物用純水重懸，再離心，并重復3-4次，以充分去除液體中游離DNA；將沉淀物重懸，獲得未染色的精子細胞懸液；或加入5μL左右的1％酸性品紅染色液染色1min獲得經染色的精子細胞懸液；

取50μL的未染色或染色的精子細胞懸液滴加到干凈載玻片上，將其放置于顯微鏡載物架上，靜置2min，讓精子細胞能夠充分沉降到載玻片表面，以利于精子細胞的提取；選擇好合適的視野，調節毛細針管，將其移至精子細胞附近，并通過調節油泵的細螺旋，控制精子細胞的吸入同時計數；將吸針抬離液面，將針頭浸入含有裂解液的1.5mL?eppendorf管中，油泵細螺旋，將精子細胞緩慢打出，觀察直至針頭上方的空氣柱進入到液體中，有小氣泡冒出為止；獲得捕獲出的單細胞，重復如上步驟，獲得多個單細胞。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型包括：

利用所述低體積擴增系統，以及STR?Identifiler或STR?MiniFiler熒光標記復合擴增試劑盒對所述單個細胞的DNA進行擴增分型。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述利用低體積擴增系統對捕獲的所述單個細胞的DNA進行擴增分型具體包括：

把捕獲的精子細胞置于低體積擴增反應玻片上，加入0.75μL精子細胞裂解液，5μL封閉液密封，56℃孵育1h，99℃孵育10min，然后利用加樣尖穿過封閉液再加入0.75μL?Master?mix，按照所述STR?Identifiler試劑盒或所述STRMinifiler試劑盒擴增條件設定程序進行擴增分型。