[發(fā)明專利]一種糖苷內切酶催化同位素標記N-糖鏈的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010222361.2
• 申請日: 2010-07-09
• 公開（公告）號: CN101906452A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 張偉;汪泓;楊芃原
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發(fā)明屬分析化學技術領域，具體涉及一種同位素標記N-糖鏈的方法，尤其涉及一種糖苷內切酶催化的同位素¹⁸O標記N-糖鏈的方法。

背景技術

蛋白質糖基化是生物體內最普遍、最重要、也是最復雜的蛋白質翻譯后修飾（PTMs）之一。蛋白質糖基化修飾始于內質網和高爾基體，成熟后或定位于質膜、胞質中發(fā)揮功能；或分泌到細胞外，形成分泌蛋白。糖鏈在生物功能方面發(fā)揮著重要作用，糖鏈會影響蛋白的結構、定位和功能，影響分子和細胞的識別、信號傳導和相互作用等等。此外，許多疾病也與糖基化的異常有著密切關系，在臨床研究上，糖蛋白與糖鏈是潛在的疾病分子標志物和藥物靶標。

因此，研究不同生理或疾病狀態(tài)下糖鏈相對量的變化具有重要意義，定量糖組學也應運而生。定量糖組學的分析方法主要是利用同位素標記技術，即將同位素標記的糖鏈與不標記的糖鏈等量混合，并由質譜檢測。在質譜中，同位素標記的糖鏈與不標記的糖鏈離子化效率相當，并形成有一定道爾頓差異的兩個獨立峰，根據峰強或峰面積比即可實現糖鏈的相對定量。目前，糖鏈的同位素標記方法主要有三種：基于同位素碘甲烷的全甲基化同位素標記，基于同位素苯胺的糖鏈還原末端同位素標記，和基于代謝方法的同位素標記。但是，這些方法都存在一定的弊端，前兩種方法涉及化學反應，需要額外的反應試劑和步驟，這不僅影響標記效率，而且會產生副反應，對后續(xù)分析十分不利；而后一種方法不僅操作復雜，而且只能用于細胞樣品，應用范圍有限。

本發(fā)明提出的酶催化同位素標記糖鏈的方法，采用了生物酶催化反應，避免了化學反應對樣品產生的不利影響；且同位素¹⁸O不影響糖鏈的質譜離子化效率，¹⁸O標記的糖鏈與不標記的糖鏈離子化效率完全相同，可以高效地用于糖鏈相對定量。本發(fā)明提出的酶催化同位素標記糖鏈的方法，彌補了糖鏈同位素¹⁸O標記技術的空白，在糖組學、糖生物學、生物醫(yī)學等領域有著良好的應用前景。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提出一種簡單、高效、無副反應的酶催化同位素標記糖鏈的方法。

本發(fā)明提出的酶催化同位素標記糖鏈的方法，即糖苷內切酶催化同位素標記N-糖鏈的方法，是在糖苷內切酶的作用下，在N-糖鏈的還原末端標記上一個同位素¹⁸O分子，它包括以下步驟：將糖蛋白樣品和糖苷內切酶溶于¹⁸O水（H₂¹⁸O）配置的緩沖溶液中，糖蛋白在緩沖溶液中的濃度為0.1-10微克/微升；將溶液放置于37℃進行酶解，酶解時間12-20小時；將溶液用超濾管進行超濾，去除酶解后的蛋白和糖苷內切酶；將緩沖溶液用石墨化碳柱進行處理，去除緩沖溶液中的鹽；將溶液冷凍干燥，并質譜檢測標記，標記的糖鏈在質譜中表現為比不標記的糖鏈分子量高2道爾頓的獨立峰。

糖苷內切酶主要包括以下幾種亞型：Endo?H、Endo?F₁、Endo?F₂或Endo?F₃，或者廣義上的糖苷內切酶PNGase?F、PNGase?A。所有糖苷內切酶亞型均適用于本發(fā)明，僅緩沖溶液需做相應改變。

本發(fā)明的積極效果如下：

1、簡單、高效，不需要額外的試劑和步驟，不產生副反應，避免了化學反應的不利因素；

2、只要酶解反應發(fā)生，標記反應就發(fā)生，標記效率高；

3、標記的糖鏈，其物理、化學性質穩(wěn)定；

4、標記無樣品類型限制，應用范圍廣；

5、同位素¹⁸O不影響糖鏈的質譜離子化效率，標記與不標記的糖鏈離子化效率完全相同。

附圖說明

圖1為MALDI質譜檢測糖苷內切酶Endo?H催化的同位素¹⁸O標記和不標記的糖鏈的質譜譜圖。上圖是不標記的糖鏈譜圖，下圖是同位素¹⁸O標記的糖鏈譜圖。譜圖清晰地顯示了同位素¹⁸O標記和不標記的糖鏈峰之間2道爾頓分子量的差異。該圖所用的糖蛋白樣品為蔗糖酶（Invertase）。G及其數字表示糖鏈中乙酰葡糖胺的數量；M及其數字表示糖鏈中甘露糖的數量。所有離子均為單電荷的鈉離子加合物。

圖2為圖1中G₁M₁₀糖鏈峰的放大圖。上圖為不標記的G₁M₁₀譜圖，下圖為同位素¹⁸O標記的G₁M₁₀譜圖。