[發明專利]羊包蟲可溶性抗原的制備方法及其產品

有效

• 申請號: 201010222212.6
• 申請日: 2010-07-09
• 公開（公告）號: CN102311957A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 張志芳;李軼女;易詠竹;賈如;韓賓;鄒媛媛;沈桂芳;舒惠國
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/866;C12N15/81;C07K14/435;A61K39/00;A61K38/17;A61P33/10
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

1.一種制備羊包蟲可溶性抗原的方法，包括：將SEQ?ID?NO：1、SEQ?IDNO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因在昆蟲生物反應器或畢赤酵母生物反應器中進行表達；收集、純化所表達的抗原，即得。

2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：將SEQ?ID?NO：1、SEQ?IDNO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因在昆蟲生物反應器中進行表達包括以下步驟：(1)將SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因分別克隆到桿狀病毒運載載體中，獲得轉移載體；(2)用所獲得的轉移載體DNA與桿狀病毒基因組DNA共轉染進昆蟲細胞，進行DNA同源重組，經過重組病毒篩選、克隆純化獲得重組桿狀病毒；(3)用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主和細胞；培養被感染的昆蟲宿主；(4)收集、純化所表達的抗原，即得。

3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的桿狀病毒運載載體選自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac?to?Pac，Bacmid，pVL1391，pVL?1392，pVL?1393，pVL941，pVL?945，pVL?985，pVTBac，pBm030或pUAC-5；優選為pBm93。

4.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或SpltNPV；優選的，所述的桿狀病毒為家蠶桿狀病毒Bm-NPV-ZJ8。

5.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的重組桿狀病毒選自以下任意一種：(1)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg95)，其微生物保藏號是：CGMCC?No.3981；(2)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(sj-GST-eg95)；其微生物保藏號是：CGMCC?No.3959；(3)重組家蠶核型多角體病毒rBmNPV(eg-GST-eg95)；其微生物保藏號是：CGMCC?No.3960。

6.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的昆蟲宿主包括家蠶(Bombyx?mori)、野蠶(Bombyx?mandarina)、蓖麻蠶(Philosamia?cynthiaricim)、樟蠶(Dictyoploca?japanica)、樗蠶(Philosamia?cynthiapryeri)、柞蠶(Antheraea?pernyi)、日本柞蠶(Antheraea?yamamai)、野天蠶(Antheraea?polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa?califorica)、茶尺蠖(Ectropis?obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra?brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera?littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera?frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia?ni)、行軍蟲(Thaumetopoea?wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis?armigera)、美國棉鈴蟲(Heliothis?zea)、煙青蟲(Heliothisassulta)、煙草夜蛾(Heliothis?virescens)、東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria?dispar)。

7.按照權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的感染是指重組桿狀病毒通過吞食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優選的：將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞或穿刺接種5齡起蠶的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集含各種羊包蟲抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體為1-2天的早期嫩蛹。

8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于：將SEQ?ID?NO：1、SEQ?IDNO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因在畢赤酵母生物反應器中進行表達包括以下步驟：(1)將SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：5所示的基因分別克隆到畢赤酵母表達載體中，獲得表達質粒；(2)先將所獲得的表達質粒DNA進行線性化，轉化酵母的感受態細胞，在酵母細胞內進行DNA同源重組進行雙交換，獲得大量的重組酵母，篩選得到最高表達的重組酵母；(3)將所獲得的重組酵母進行發酵收獲發酵的上清液，純化即得。