[發明專利]一種抗菌多肽及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010219705.4
• 申請日: 2010-06-28
• 公開（公告）號: CN102295694A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 張日俊;胡曉年;解軍;于保鋒;李翔;王俊麗;向前;余占橋;馬青山;趙龍妹
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/19;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10;A61P31/12;A23K1/17;A01N61/00;A01P1/00;A01P3/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種抗菌多肽以及該抗菌多肽的制備方法和用途。

背景技術

抗生素對于控制、預防和治療各種感染性疾病發揮了重要作用。由于抗生素的使用，到20世紀80年代，人類幾乎可以征服所有的感染類疾病，然而，隨著時間的推移以及抗生素的濫用，耐藥菌株愈來愈多。有監測發現，最具代表性的耐藥菌株當中，耐藥的葡萄球菌已上升到40％；耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌則超過77％。現在，已經出現了能對抗所有抗生素的耐藥菌，很明顯，抗生素耐藥問題已經嚴重威脅到人類的健康。

解除耐藥菌對人類日益嚴重的威脅已經是一個相當迫切的問題，因此新一類抗微生物物質的發現和研制已經成為國際上研究的熱點。多肽類抗菌物質與目前廣泛使用的傳統類抗生素相比，具有很多優點：如在最小作用濃度時，快速而廣譜的殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)，對真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，對局部感染和全身感染都有效。目前，已從不同生物中提取出多種抗菌肽。

人防御素屬于抗菌肽家族，是存在于人多形核中性粒細胞、巨噬細胞、小腸Paneth細胞中的一組同源肽類，是富含精氨酸殘基的陽離子多肽，分子量為4～6kDa，分子中含有6-8個Cys殘基，并形成3～4對分子內二硫鍵，具有穩定的分子結構和廣譜抗菌活性。在體內外對多種細菌、病毒、腫瘤細胞、癌實體瘤、真菌和原蟲均有抑殺作用，且微生物不易對其產生抗性。因此人防御素有望成為理想的抗生素替代品，具有巨大的應用價值。但由于抗菌肽在生物體中含量不高，且提取困難，成本高，故尋找來源易，成本低、效價高的抗菌肽正受到廣泛的重視。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種抗菌多肽；

本發明的第二個目的在于提供編碼該抗菌多肽的基因；

本發明的第三個目的在于提供該抗菌多肽的制備方法；

本發明的再一個目的在于提供該抗菌多肽的用途。

本發明在對人防御素4的序列、結構分析的基礎上，進行改進優化，與人防御素4相比，除了具有抗菌作用外，還有抗病毒作用，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列，例如，將第6位的Leu替換為Ile，或者在其末端缺失Thr?Arg?Val三個氨基酸。因此，本發明抗菌多肽還包括SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有同等功能的由SEQ?ID?No.2衍生得到的多肽。為方便表述，將該多肽命名為ABP-j1。本發明基因包括編碼所述多肽的核酸序列，優選其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。

可將本發明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明多肽的重組表達載體，進而可以通過諸如電轉化法等轉基因方法，將所述表達載體導入宿主細胞，得到轉ABP-j1基因的轉化體，例如基因工程菌。

因此，本發明還包括含有編碼上述抗菌多肽的表達載體，以及轉化了該表達載體的宿主細胞。

本發明還提供了一種制備上述多肽的方法，其是將上述表達載體轉化宿主菌，篩選陽性克隆，誘導表達權利要求1所述抗菌多肽，并分離純化。

在本發明的一個實施例中，將編碼上述多肽的基因(其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示)克隆至表達載體pPIC9K，得到重組表達載體pPIC9K-ABP-j1，進而通過電擊法轉化入畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115中；通過同源重組整合到酵母染色體上；用G418篩選高表達菌株；甲醇誘導表達。

具體地，本發明制備上述多肽的方法包括如下步驟：

1、該抗菌多肽的重組畢赤酵母表達載體的構建：根據ABP-j1核酸序列和畢赤酵母表達載體pPIC9K上的限制性內切酶位點特性，在ABP-j1核酸序列上下游分別增加EcoRI和NotI位點，用EcoRI和NotI雙酶切，再與EcoRI和NotI雙酶切過的pPIC9K相連，轉化大腸桿菌DH5α，構建該抗菌多肽的畢赤酵母表達載體pPIC9K-ABP-j1。提取質粒，經EcoRI和NotI雙酶切、測序鑒定。證實該抗菌多肽畢赤酵母表達載體pPIC9K-ABP-j1構建成功。