[發明專利]一種抗菌多肽及其制備方法和應用有效
| 申請號: | 201010219705.4 | 申請日: | 2010-06-28 |
| 公開(公告)號: | CN102295694A | 公開(公告)日: | 2011-12-28 |
| 發明(設計)人: | 張日俊;胡曉年;解軍;于保鋒;李翔;王俊麗;向前;余占橋;馬青山;趙龍妹 | 申請(專利權)人: | 中國農業大學 |
| 主分類號: | C07K14/47 | 分類號: | C07K14/47;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/19;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10;A61P31/12;A23K1/17;A01N61/00;A01P1/00;A01P3/00 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 抗菌 多肽 及其 制備 方法 應用 | ||
技術領域
本發明屬于生物工程領域,涉及一種抗菌多肽以及該抗菌多肽的制備方法和用途。
背景技術
抗生素對于控制、預防和治療各種感染性疾病發揮了重要作用。由于抗生素的使用,到20世紀80年代,人類幾乎可以征服所有的感染類疾病,然而,隨著時間的推移以及抗生素的濫用,耐藥菌株愈來愈多。有監測發現,最具代表性的耐藥菌株當中,耐藥的葡萄球菌已上升到40%;耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌則超過77%。現在,已經出現了能對抗所有抗生素的耐藥菌,很明顯,抗生素耐藥問題已經嚴重威脅到人類的健康。
解除耐藥菌對人類日益嚴重的威脅已經是一個相當迫切的問題,因此新一類抗微生物物質的發現和研制已經成為國際上研究的熱點。多肽類抗菌物質與目前廣泛使用的傳統類抗生素相比,具有很多優點:如在最小作用濃度時,快速而廣譜的殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌),對真菌也有抑制作用,抗性菌株生成性小,對局部感染和全身感染都有效。目前,已從不同生物中提取出多種抗菌肽。
人防御素屬于抗菌肽家族,是存在于人多形核中性粒細胞、巨噬細胞、小腸Paneth細胞中的一組同源肽類,是富含精氨酸殘基的陽離子多肽,分子量為4~6kDa,分子中含有6-8個Cys殘基,并形成3~4對分子內二硫鍵,具有穩定的分子結構和廣譜抗菌活性。在體內外對多種細菌、病毒、腫瘤細胞、癌實體瘤、真菌和原蟲均有抑殺作用,且微生物不易對其產生抗性。因此人防御素有望成為理想的抗生素替代品,具有巨大的應用價值。但由于抗菌肽在生物體中含量不高,且提取困難,成本高,故尋找來源易,成本低、效價高的抗菌肽正受到廣泛的重視。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種抗菌多肽;
本發明的第二個目的在于提供編碼該抗菌多肽的基因;
本發明的第三個目的在于提供該抗菌多肽的制備方法;
本發明的再一個目的在于提供該抗菌多肽的用途。
本發明在對人防御素4的序列、結構分析的基礎上,進行改進優化,與人防御素4相比,除了具有抗菌作用外,還有抗病毒作用,其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
應當理解,本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列,在不影響其活性的前提下,取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸,得到所述蛋白的突變序列,例如,將第6位的Leu替換為Ile,或者在其末端缺失Thr?Arg?Val三個氨基酸。因此,本發明抗菌多肽還包括SEQ?ID?No.2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸,具有同等功能的由SEQ?ID?No.2衍生得到的多肽。為方便表述,將該多肽命名為ABP-j1。本發明基因包括編碼所述多肽的核酸序列,優選其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
此外,應理解,考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性,本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。
可將本發明基因與表達載體可操作地連接,得到能夠表達本發明多肽的重組表達載體,進而可以通過諸如電轉化法等轉基因方法,將所述表達載體導入宿主細胞,得到轉ABP-j1基因的轉化體,例如基因工程菌。
因此,本發明還包括含有編碼上述抗菌多肽的表達載體,以及轉化了該表達載體的宿主細胞。
本發明還提供了一種制備上述多肽的方法,其是將上述表達載體轉化宿主菌,篩選陽性克隆,誘導表達權利要求1所述抗菌多肽,并分離純化。
在本發明的一個實施例中,將編碼上述多肽的基因(其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示)克隆至表達載體pPIC9K,得到重組表達載體pPIC9K-ABP-j1,進而通過電擊法轉化入畢赤酵母(Pichia?pastoris)GS115中;通過同源重組整合到酵母染色體上;用G418篩選高表達菌株;甲醇誘導表達。
具體地,本發明制備上述多肽的方法包括如下步驟:
1、該抗菌多肽的重組畢赤酵母表達載體的構建:根據ABP-j1核酸序列和畢赤酵母表達載體pPIC9K上的限制性內切酶位點特性,在ABP-j1核酸序列上下游分別增加EcoRI和NotI位點,用EcoRI和NotI雙酶切,再與EcoRI和NotI雙酶切過的pPIC9K相連,轉化大腸桿菌DH5α,構建該抗菌多肽的畢赤酵母表達載體pPIC9K-ABP-j1。提取質粒,經EcoRI和NotI雙酶切、測序鑒定。證實該抗菌多肽畢赤酵母表達載體pPIC9K-ABP-j1構建成功。
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