[發明專利]用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的引物組及檢測體系

有效

• 申請號: 201010217280.3
• 申請日: 2010-07-05
• 公開（公告）號: CN101892323A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 趙化冰;高宏生;趙宏;李國良;孟斌;張國輝;黃愛華;王俊虹;王毅錚;尹光雅;趙國平
• 申請（專利權）人: 中國人民武裝警察部隊醫學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明涉及一種用環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)檢測脊髓灰質炎病毒的引物組、檢測體系、檢測方法及用途。

背景技術

脊髓灰質炎(脊灰)病毒是腸道病毒的一種，常侵犯中樞神經系統，導致肢體松弛性麻痹，多見于兒童，故又名小兒麻痹癥。該病流行于全世界，嚴重威脅著人類的健康。1988年世界衛生大會通過了全球2000年消滅脊灰的目標，脊灰病毒野毒株的感染報道明顯下降，但由疫苗衍生的脊灰病毒同時成為一種致命的流通形式。因此，加強對于脊灰病毒的檢測，建立一種快速、準確的檢測方法，有著十分重要的意義。

腸道病毒的傳統檢測方法為病毒分離培養，然后進行血清中和試驗定型分類，此法繁瑣、耗時、費力，雖然多數培養結果可在1周內得到，但中和試驗卻十分費時，昂貴，甚至有時無法定型。PCR方法具有快速、敏感性強、特異性高等諸多優點，已應用于脊髓灰質炎的檢測。但PCR方法存在對檢測設備要求高，結果判斷不直觀等問題，限制其在基層單位的應用。2000年，Notomi?T等發明的LAMP技術縮短了擴增時間，提高了擴增效率，并且具有更高的靈敏度、特異性，降低了儀器設備及檢測條件的要求，被公認為具有較強實用性的分子檢測技術。目前，LAMP技術已經成功應用于多種病毒的檢測，如SARS冠狀病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等。本研究建立了一種專門針對脊髓灰質炎病毒基因的LAMP檢測方法，

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供了一種用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的引物組；

本發明的第二個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的檢測體系。

本發明的第三個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的方法。

本發明的第四個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的檢測體系的用途。

本發明的技術方案概述如下：

用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的引物組，它由序列表中SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列、SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列、SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列和SEQ?ID?NO.4所示核苷酸序列組成。

用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的檢測體系，該體系由下述原料組成：

10×的ThermoPol緩沖液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺?3μL-7μL；

5mol/L的Betaine?1μL-6μL；

50mmol/L的dNTP?0.6μL-1μL；

10μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列0.4μL；

100μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.4所示核苷酸序列0.4μL；

8U/μL的Bst酶1μL；

加超純水至總體積為20μL。

用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的方法，它包括下述步驟：

(1)提取待檢測樣品中的病毒RNA并逆轉錄為cDNA；(2)取5μL所述cDNA加入到20μL的用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的檢測體系中，10000轉/分鐘，離心30秒；(3)加入20μL礦物油，于60℃恒溫中進行環介導恒溫擴增技術擴增1-1.5小時；(4)取出反應管，加入8μL-10μL?SYBR?Green?Ⅰ型核酸染料，若反應液變成綠色，則說明待測樣品中存在脊髓灰質炎病毒，若為桔黃色，則說明待測樣品中不存在脊髓灰質炎病毒，所述用環介導恒溫擴增技術檢測脊髓灰質炎病毒的檢測體系由下述原料組成：

10×的ThermoPol緩沖液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺?3μL-7μL；

5mol/L的Betaine?1μL-6μL；

50mmol/L的dNTP?0.6μL-1μL；

10μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列0.4μL；

100μmol/L的序列表中SEQ?ID?NO.4所示核苷酸序列0.4μL；