[發明專利]HLA-A,B基因分型用PCR引物及其使用方法

有效

• 申請號: 201010213721.2
• 申請日: 2010-06-30
• 公開（公告）號: CN101921842A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 李劍;劉瑩;陳仕平;張彩芬
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

技術領域

本發明涉及核酸測序技術領域，特別是PCR測序技術領域。特別地，本發明提供了用于HLA-A，B(第二代測序法)基因分型的PCR引物。另一方面，本發明的方法涉及DNA序列的分型方法，特別是HLA基因高分辨率分型方法。

背景技術

人類白細胞抗原，即HLA(human?leukocyte?antigen，HLA)，是迄今為止發現的多態性最高的基因系統之一，它是調控人體特異性免疫應答和決定疾病易感性個體差異的主要基因系統，與同種異體器官移植的排斥反應密切相關。研究發現，移植時，供受雙方的HLA相關基因匹配程度越高，分辨率越高，移植物的存活時間越長。

目前國際標準的HLA基因分型技術包括PCR-SSP(序列特異引物聚合酶鏈式反應)，PCR-SSO(聚合酶鏈式反應寡核苷酸探針雜交)和PCR-SBT(聚合酶鏈式反應產物直接測序分型)。

HLA-SSP的原理是設計出一整套等位基因組特異性引物，借助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，通過電泳分析決定HLA型別。HLA-SSO的原理是設計HLA型別特異的寡核苷酸序列作為探針，把PCR產物標記，以PCR產物(待檢測基因DNA)與探針雜交。通過檢測熒光信號判斷HLA型別。HLA-SSP和HLA-SSO的檢測信號均是模擬信號，分辨率只能到達中低水平且都不能檢測新的等位基因。

HLA-SBT是一種通過對HLA基因的相關區域(HLA-A/B基因分型一般同時擴增2，3，4外顯子用于分型，其PCR產物長度都在1kb以上)PCR擴增后的DNA產物直接進行Sanger法測序(毛細管?微電泳)，測定核酸序列，從而判斷HLA基因型別的高分辨分型方法，其具有直觀、高分辨且能檢測新的等位基因的特點。HLA-SBT整個實驗流程復雜、通量低和實驗成本高等缺點使其很難應用于大規模HLA高分辨分型項目。

基于以Illumina?GA(Illumina公司的Genome?Analyzer測序儀)和Roche?454(Roche公司)為代表的第二代測序法(以下簡稱新測序技術)的HLA-SBT也是一種通過對PCR擴增后的DNA產物直接測定核酸序列，從而判斷HLA基因型別的高分辨分型方法，其除了原有直觀、高分辨且能檢測新等位基因的特點外，還具有單分子測序特點。其結合PCR-index/barcode技術，通過在PCR引物的5’末端添加引物標簽(primer?index)序列合成標簽引物，可在PCR過程中對每個樣本引入獨特的引物標簽，使樣本在利用第二代DNA測序技術檢測過程中，除PCR環節必須逐個樣本處理外，其它實驗環節可把多個樣本混在一起同時處理，最終每個樣本的檢測結果可以通過其獨特的引物標簽序列找回；使該方法具有成本低，通量大和可同時檢測大量樣本的多個不同基因位點的特點。但與第一代測序技術(以Sanger法測序原理為基礎的測序技術)相比，能用于新測序技術測序文庫制備的DNA長度不能太長(Illunina?GA的最大適用長度為700bp)，再加上新測序技術讀長普遍偏短，當前Illumina?GA雙向讀長只能達到200bp，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再適用。結合HLA新測序技術的特點，PCR產物的長度不宜超過700bp。

發明內容

鑒于現有新測序技術對DNA模板長度的要求和新測序技術讀長偏短的事實，原用于HLA-SBT方法的PCR引物不再適用以新測序技術為基礎的HLA高分辨分型方法。本發明設計了一套全新的分別單獨擴增HLA-A，B基因的2，3，4號外顯子的特異性和保守性良好的PCR引物，且PCR產物長度不大于700bp，特別適用于Illumina?GA(當前Illumina?GA適用的最大DNA長度為700bp)。本發明所提供?的一套PCR引物可用于對受試者(特別是人)進行大規模、高通量和低成本的HLA基因分型。

本發明采用的技術方案是，從IMGT/HLA因特網站點(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)下載所有最新HLA-A/B基因序列，然后保存到本地磁盤中做為HLA-A數據集；同時下載所有最新非HLA-A的HLA-I類基因序列做為比較數據集。將兩數據集進行比較，在2，3，4號外顯子兩端和內部尋找各基因位點保守和特異序列，并將設計的PCR引物序列與人類全基因組序列進行同源性比較。由于HLA-A/B基因與同屬于HLA-I類分子的其它基因具有很高的序列相似性，在設計PCR引物時盡量保證引物3’末端特異，確保引物擴增HLA-A/B基因的特異性。同時使PCR產物的長度小于700bp，且正反引物的退火溫度基本保持一致。