[發(fā)明專利]氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010210402.6
• 申請日: 2010-06-23
• 公開（公告）號: CN102298056A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/84
• 分類號: G01N33/84;G01N21/31;G01N35/00;C12Q1/527;C12Q1/26
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【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。?

【背景技術(shù)】

氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。?

擴散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH₃，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴散法更準(zhǔn)確，CV為8％～13％；離子選擇電極法是利用NH₃擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為3.5％～4.8％，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。?

檢索中國專利，僅查出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。?

【發(fā)明內(nèi)容】

[要解決的技術(shù)問題]?

本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。?

本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。?

[技術(shù)方案]?

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。?

本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple?Reaction)的聯(lián)用技術(shù)，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。?

本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫羧酶、氰化氫合成酶的系列催化反應(yīng)完成：?

氨+過氧化氫+2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水?

谷氨酸谷氨酸脫羧酶4-氨基丁酸(aminobutanoate)+二氧化碳?

二氧化碳+氰化氫+2還原型輔酶氰化氫合成酶甘氨酸+2輔酶?

本發(fā)明的方法利用谷氨酸氧化酶(Glutamate?oxidase；EC?1.4.3.7；EC?1.4.3.11)酶(偶)聯(lián)谷氨酸脫羧酶(glutamate?decarboxylase；EC?4.1.1.15)、氰化氫合成酶(hydrogen?cyanide?synthase；EC?1.4.99.5)酶促反應(yīng)比色終點法。谷氨酸氧化酶酶解氨反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酸，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸脫羧酶、氰化氫合成酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。?

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。?

本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下：?

A、樣品準(zhǔn)備：?

A.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備?

將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；

A.2待測樣品的制備?

待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；?

A.3空白樣品?

所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；?

B、試劑溶液的制備：?

分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫羧酶、氰化氫合成酶、過氧化氫、2-酮戊二酸與氰化氫，然后將它們混合均勻，用水?溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L與1-100mmol/L；?

C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45℃下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；?

D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化；?

E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；?