[發(fā)明專利]半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010210270.7
• 申請日: 2010-06-23
• 公開（公告）號: CN102297977A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王爾中
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/66
• 分類號: G01N33/66;G01N21/31;G01N35/00;C12Q1/54;C12Q1/48;C12Q1/32;C12Q1/25
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1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的半乳糖濃度測定方法，其測定的技術(shù)原理是根據(jù)下述半乳糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成：

半乳糖+腺苷三磷酸??半乳糖激酶??腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸

腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸??丙酮酸羧化酶??腺苷三磷酸+丙酮酸

????????????????????????????????????????????????+二氧化碳

二氧化碳+還原型輔酶??甲酸脫氫酶??甲酸+輔酶。

2.一種半乳糖的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下：

2.1樣品準(zhǔn)備：

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到100微摩爾/升；

2.1.2待測樣品的制備

待測液體樣品直接測試；將一定量的待測固體樣品(如乳粉)像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；

2.1.3空白樣品

所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升；

2.2試劑溶液的制備：

分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價(jià)磷酸鹽(磷酸根)與草酰乙酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-100mmol/L、1-100mmol/L與1-100mmol/L；

2.3待測樣品與在步驟2.2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進(jìn)行混合，在溫度15-45℃下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設(shè)副波長)下進(jìn)行測定，測定其吸光度隨時(shí)間的變化；

2.4在與步驟2.3)同樣的條件下測定步驟2.1.1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時(shí)間的變?化；

2.5在與步驟2.3)同樣的條件下測定在步驟2.1.3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時(shí)間的變化；

2.6數(shù)據(jù)處理

由步驟2.3-2.5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時(shí)間的變化，根據(jù)下式計(jì)算得到半乳糖的含量：

式中：

ΔA(樣品)表示步驟2.3)得到的待測樣品的吸光度變化；

ΔA(空白)表示步驟2.5)得到的空白溶液的吸光度變化；

ΔA(標(biāo)準(zhǔn))表示步驟2.4)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度變化。

3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動(dòng)生化分析儀測定時(shí)，待測樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下自動(dòng)取樣，然后在下述條件下進(jìn)行測定：測定方法為終點(diǎn)法，溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)，延遲時(shí)間1/0分鐘，檢測時(shí)間4/5分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio-NADH的還原型輔酶。