[發明專利]一種RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法

有效

• 申請號: 201010209986.5
• 申請日: 2010-06-28
• 公開（公告）號: CN101878747A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 尹文;孫夢寧;趙亞;呂欣;雷迎峰;楊敬;康健;馬玉;蘭海云;姚敏
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/54;C12N15/85;C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)分別以基因組重組了RdRp可調控表達載體的轉基因小鼠和Cre/Lap雙轉基因小鼠為親本進行雜交：由1只雄性Cre/Lap雙轉基因小鼠與2只雌性RdRp單轉基因小鼠進行交配，或者由1只雄性RdRp單轉基因小鼠與2只雌性Cre/Lap雙轉基因小鼠進行交配；

2)選擇繁殖能力強的親本的子代，且通過PCR擴增鑒定基因組包含Cre、Lap和RdRp基因的個體，作為Cre/Lap/RdRp三轉基因小鼠的F1代子代；

3)分別以F1代子代和正常的小鼠為親本進行雜交：由1只雄性Cre/Lap/RdRp三轉基因小鼠與2只雌性正常小鼠進行交配，或者由1只雄性正常小鼠與2只雌性Cre/Lap/RdRp三轉基因小鼠進行交配；

篩選繁殖能力強，并且基因組包含Cre、Lap和RdRp基因的子代個體，繼續與正常小鼠交配，繁殖擴群，直至得到Cre/Lap/RdRp穩定遺傳的模型小鼠。

2.如權利要求1所述的RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的RdRp可調控表達載體為PBI-3-Luc-pA-RdRp表達載體，包含有RdRp-雙向啟動子Ptetbi-1-lacZ-loxP-Luciferase-polyA-loxP所示的元件排列。

3.如權利要求2所述的RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的PBI-3-Luc-pA-RdRp表達載體的構建為：

1)在含有雙向啟動子Ptetbi-1的真核表達載體PBI-3的lacZ報告基因的另一側順序加入loxP、Luciferase、polyA、loxP調控元件及報告基因，構建真核表達載體PBI-3-Luc-pA；

loxP、Luciferase、polyA調控元件的核苷酸序列分別如SEQ.ID.NO.1～3所示；

2)以引物對P為引物，以包含RdRp基因的載體或基因組為模板，PCR擴增RdRp基因，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；所述的引物對P為：

上游引物：gaagcggccg?catgtcgatg?tcctacacat??30；

下游引物：gccgtcgact?catcggttgg?ggagtagat???29；

3)用Sal?I和Not?I雙酶切表達載體PBI-3-Luc-pA并回收的大片段，將回收的大片段用T₄連接酶與同樣Sal?I和Not?I雙酶切的RdRp基因擴增片段連接，得到表達載體PBI-3-Luc-pA-RdRp。

4.如權利要求1所述的RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的Cre/Lap雙轉基因小鼠為表達Cre重組酶基因和Lap肝臟啟動子的小鼠，受到鹽酸強力霉素調控誘導后熒光素酶在肝臟開始表達的小鼠。

5.如權利要求1所述的RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的Cre/Lap/RdRp三轉基因小鼠在受到鹽酸強力霉素誘導后，Cre重組酶被啟動表達表達，并特異性地切除兩個loxP位點之間包括polyA的終止序列，rtTALAP-1中的rtetR分子與Ptetbi-1中的tetO序列特異性結合，RdRp基因開始表達。

6.如權利要求1所述的RdRp可調控表達和活體觀測的小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的用于雜交的親本小鼠為6～8周齡。