[發明專利]利用三尖杉培養細胞生物合成松香烷二萜類化合物的方法

有效

• 申請號: 201010206950.1
• 申請日: 2010-06-23
• 公開（公告）號: CN102295545A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 張衛;徐曉輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07C49/245
• 分類號: C07C49/245;C07C45/00;C07C39/17;C07C37/00;C07C49/747;C07C35/42;C07C29/00;C07C49/755;C12N5/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及植物細胞培養技術，具體的說是一種誘導三尖杉液體懸浮培養細胞生物合成松香烷二萜類化合物的方法，同時產物中包括一個新的化合物。

背景技術

松香烷二萜類化合物屬于三環二萜類化合物，是一類重要的天然化合物。這類化合物之所以引起人們的研究興趣主要是因為它們中的很多物質具有良好的活性，很多民間用藥中含有這類物質。比如，本發明中的hinokiol(化合物2)對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等具有抑制作用，是很好的抗菌先導化合物。然而，目前這類化合物主要來源于從植物中提取，關于其化學合成的報道很少，且還處于實驗室研究階段。由于這類化合物在植物中的含量很低，獲得困難，大大限制對其進一步的研究和應用。

利用植物細胞培養技術生產生物活性物質因其環境友好、生產周期短、可控性強等優點日益受到人們的重視，成為天然活性物質的潛在來源。而目前人們遇到的主要問題是怎樣調控植物的代謝途徑進而獲得預期的產物，像控制化學合成一樣來控制生物合成。

目前常見的調控方法主要是促進細胞中已經存在的次生代謝產物的生產，也就是提高其產率。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用三尖杉(Cephalotaxus?fortunei，Hook，f.)液體懸浮培養細胞，以誘導劑誘導和吸附劑吸附相結合的聯合調控技術生物合成7種松香烷二萜類化合物，包括一個新的松香烷二萜化合物的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

將三尖杉細胞置于其常用培養基中培養，細胞接種量為50～150g/L濕重，在細胞指數生長初期，于每升培養基中同時加入濃度為10～2000μM的誘導劑和50～200g的吸附劑，所述誘導劑為非生物誘導劑或真菌誘導子；繼續培養7～14天后，分別收獲細胞和吸附劑；

第一次提取：室溫下，將真空抽濾后的吸附劑先用極性或中等極性有機溶劑提取2～5次；合并提取液，過濾，旋轉蒸干；

第二次提取：在蒸干的粗提物中加入低濃度的堿液以及等體積的非極性有機溶劑萃取，粗提物與低濃度的堿液質量體積比例1g∶3～15ml；

分離純化：萃取8～16小時后，將有機層分離出來，將有機層旋轉蒸干，然后置于硅膠柱上分離，所用硅膠為200～300目硅膠，洗脫方式為梯度洗脫，每個梯度所用洗脫液的體積為200-800ml，用樣品瓶連續收集洗脫液，每個樣品瓶收集5-15ml洗脫液，同時利用薄層色譜對樣品瓶收集的洗脫液進行檢測，當所用的洗脫液為環己烷-乙酸乙酯(8∶1，v/v)時，分別得到化合物1和4的粗品；環己烷-乙酸乙酯(5∶1，v/v)時，分別得到化合物3和6的粗品；環己烷-乙酸乙酯(2∶1，v/v)時，分別得到化合物2、5和7的粗品。將這7個化合物的粗品分別置于凝膠柱上完成進一步的純化，得到7個化合物的純品。這7個化合物分別為：

化合物1：3-hydroxy-2-isopropyl-6-methyl-5-(4-methyl-3-oxopentyl)naphthalene

化合物2：abieta-8，11，13-triene-3β，12-diol

化合物3：12-hydroxyabieta-6，8，11，13-tetraene-3-one

化合物4：abietatriene-3β-ol

化合物5：11，12-dihydroxy-8，11，13-abietatriene-3，7-dione

化合物6：11-hydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-3，7-dione

化合物7：3β，11-dihydroxy-12-methoxyabieta-8，11，13-triene-7-one

三尖杉培養細胞的常用培養基組成為，于MS基礎培養基中添加終濃度為0.1～2.5mg/L?2，4-二氯苯氧基乙酸，0.1～1mg/L激動素以及10～50g/L蔗糖，pH值為5.4～6.2；

細胞指數生長初期是細胞接種于培養基后的第4～10天。

三尖杉細胞的培養條件為：旋轉式搖床，轉速80～150rpm，培養溫度為20～30℃，暗培養；培養周期為14～25天，每隔14～21天傳代一次。

非生物誘導劑為硝酸銀、水楊酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；吸附劑為對萜類化合物具有較強的吸附能力并對細胞無毒的大孔吸附樹脂，包括XAD-7HP，XAD-4，XAD-1600或HP2MG。