[發明專利]銀杏防御素、編碼基因及其應用

有效

• 申請號: 201010206686.1
• 申請日: 2010-06-22
• 公開（公告）號: CN102286084A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 皮燦輝;汪猜
• 申請（專利權）人: 廣州和仕康生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;A23K1/16;A01N47/44;A01P1/00;A01P3/00;A61K38/16;A61P31/04;A61P31/10
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種銀杏防御素、其編碼基因與應用。

背景技術

1985年美國科學家Lehrer等從人的嗜中性白細胞分離純化出3種陽離子小肽，HNP-1、HNP-2與HNP-3，通過色譜、電泳與功能分析，將它們與以前從兔、豚鼠分離的同類小肽一起命名為防御素。后來發現這類小肽普遍存在于高等生物中，對病原微生物具有廣譜的毒殺效應，是高等生物防御病原體入侵的重要防御物質。

目前所知，防御素(defensins)是一類分子量很小(一般15-30殘基)，富含半胱氨酸的陽離子蛋白質，屬于抗微生物肽的一類。存在于脊椎動物、無脊椎動物和植物等生物類群中。

防御素有很強的抗細菌、真菌和具囊膜病毒的作用。雖然目前對防御素的抑菌機理尚無明確的定論，流行的觀點是帶正電的防御素與帶負電的細菌細胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的離子通道，從而擾亂了細胞膜的通透性及細胞能量狀態，導致細胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細胞ATP含量下降，最終使靶細胞死亡。防御素的抗病毒作用則是通過與病毒外殼蛋白結合而導致病毒失去生物活性。正是由于這種特殊的作用機理，使防御素具備兩個特點：一是抗性譜廣，二是目的微生物難以對防御素產生抗性突變。這就是科學家們對其應用前景看好的重要依據。

銀杏(Ginkgo?biloba)，又名白果、公孫樹，是現存裸子植物中最古老的遺植物之一，人稱“活化石”。銀杏從栽種到結果要二十多年，四十年后才能大量結果，能活到一千多歲，是樹中的老壽星。銀杏種子營養豐富，具有天然保健作用，長期食用能夠延緩衰老，益壽延年，在宋代被列為皇家貢品。

自然界中銀杏樹幾乎不會感染疾病，研究者們圍繞這種特殊的植物進行了大量的研究。例如，Huang等(2000)已經從銀杏葉子中分離純化得到一種幾丁質結合蛋白，Shen等(2005)從銀杏中克隆到一種茉莉酮酸酯依賴的防御素基因。Wang等(2000)從銀杏果仁中分離出一種具有抑制HIV-1反轉錄酶活性的新抗菌蛋白。

發明人通過構建CDNA文庫，獲得了一個新的銀杏防御素基因序列，將本發明的防御素及其編碼基因在數據庫中搜索，沒有發現任何相同序列。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種銀杏防御素。

本發明的第二個目的在于提供本發明銀杏防御素的編碼基因。

本發明的第三個目的在于將本發明的銀杏防御素應用于制備抗病菌類產品。

本發明所選擇的銀杏(Ginkgo?biloba)采自中國江蘇新沂。

本發明用構建cDNA文庫的方法，從中國江蘇新沂銀杏果仁克隆得到防御素家族成員。

銀杏果仁cDNA文庫的構建：首先分離銀杏果仁，提取總RNA。取總RNA進行反轉錄合成cDNA第一鏈產物。再取cDNA用于連接反應，轉化液分別涂板，其余用于搖總庫菌液，從平板上挑取單克隆保種。

本發明通過對以上重組克隆大規模序列測定，得到6條EST序列編碼銀杏防御素家族成員，申請人將之命名為銀杏防御素GD01，銀杏防御素成熟肽由48個氨基酸組成，等電點為9.05，分子量為5.43千道爾頓，銀杏防御素具有典型的防御素一級結構的特征，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示，具體如下：

Arg?Thr?Cys?Lys?Ser?Gln?Ser?His?Lys?Phe?Lys?Gly?Tyr?Cys?Leu?Ser?Asp?Thr

1???????????????????????????????????10

Asn?Cys?Arg?Asn?Val?Cys?Arg?Thr?Glu?Gly?Phe?Gly?Thr?Gly?Ser?Cys?Asp?Phe

????20??????????????????????????????????????30

Ala?Ser?Arg?Lys?Cys?Tyr?Cys?Tyr?Lys?Pro?Cys?Val

????????????40

該成熟肽可以通過分離純化得到，HPLC鑒定其純度達到96.5％，MALDI-TOF鑒定其分子量正確。

本發明的銀杏防御素，為如下(a)或(b)所述的多肽：

(a)具有序列表中SEQ?ID?NO：2所述的氨基酸序列，即銀杏防御素GD01；

(b)將(a)中的氨基酸序列經過個別氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。