[發明專利]熊果酸的制備方法及其在治療腫瘤疾病藥物中的用途

無效

• 申請號: 201010206500.2
• 申請日: 2010-06-22
• 公開（公告）號: CN101870720A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 吳世華;楊璐;馮國培;吳平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07J63/00
• 分類號: C07J63/00;A61K31/56;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

技術領域

本發明涉及熊果酸的制備方法及其用途，具體地說是從白花蛇舌草(Hedyotis?diffusa)全草中提取有效成分熊果酸的方法及其在治療腫瘤疾病藥物中的用途，屬于醫藥技術領域。

背景技術

熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，其分子式為C₃₀H₄₈O₃，分子量456，其化學結構如下：

人們在Oldenlandia?diffusa(O.diffusa)，Ligustrum?lucidum，Rabdosia?rubescens，Prunella?vulgaris^[1-3].等多種植物中均發現有熊果酸的分布。但是，傳統的分離制備熊果酸的方法如正相硅膠薄層色譜、正相硅膠柱色譜等方法由于固相載體的死吸附使得分離的產率和效率均很低，而發展的高效液相色譜方法僅用于其純度分析和鑒定，因此，還沒有一種能快速高效地大量制備熊果酸的方法。

一系列的研究表明，熊果酸具有強的抗腫瘤活性，也具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗潰瘍、降低血糖等多種生物學效應，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫藥和化妝品原料^[4-10]。但對于熊果酸在治療腫瘤多藥耐藥的研究報道很少，特別是對于其通過AIF介導的caspase非依賴的細胞凋亡途徑克服肝癌多藥耐藥性的研究還未見報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種快速、高效、大量制備熊果酸(Ursolic?acid)的方法。本發明的另一個目的是提供熊果酸在治療腫瘤多藥耐藥性藥物中的新用途。

熊果酸分子式為C₃₀H₄₈O₃，分子量456，CAS?nmuber：77-52-1，屬于三萜酸類化合物。其制備方法步驟如下：

將白花蛇舌草全草用乙酸乙酯提取，所得的浸膏進行正相柱及RP-C₁₈反相柱色譜分離，接著采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶劑體系進行逆流色譜分離，收集目標物質，揮發溶劑后得白色結晶性粉末，即為目的化合物熊果酸，所說的逆流色譜分離體系中正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的體積比為5∶4∶5∶4。

本發明的熊果酸在治療腫瘤疾病藥物中的用途，是在制備通過AIF介導的Caspase非依賴的細胞凋亡途徑克服肝癌多藥耐藥性的藥物中的應用。

采用本發明方法制備得到的熊果酸可以按照藥學領域的常規生產方法制成以下制劑形式：包括液體制劑、顆粒劑、片劑、沖劑、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑或注射劑。熊果酸可以作為單味制劑，也可以包含其它的增效劑，組合成抗腫瘤藥物。

本發明的有益效果在于：

(1)本發明采用吸附柱色譜和逆流色譜相結合的制備技術制備熊果酸。首先利用柱色譜的初級分離能力將含有熊果酸的白花蛇舌草提取物進行粗分，然后再利用逆流色譜制備技術的制備，具有效率高、樣品無損、快速、高收率、高純度等優點。

(2)本發明制備的熊果酸抗腫瘤藥物，具有體外強烈抑制耐藥株腫瘤細胞增殖的作用，經四甲基偶氮唑鹽(簡稱MTT法)檢測，對人肝癌多藥耐藥株細胞R-HepG2的半數抑制增殖率IC₅₀約為9.75μg/ml。而且體內外實驗發現熊果酸能通過AIF介導的caspase非依賴途徑這一機制誘導多藥耐藥性肝癌細胞R-HepG2死亡，但并不會對小鼠的機體產生明顯的毒性。因此其作為單味制劑或與藥物敷料組合，均可在制備治療耐藥性腫瘤藥物中應用。本發明為進一步新的抗惡性腫瘤多藥耐藥藥物提供了科學依據，對開發利用我國傳統中藥具有重要意義。

附圖說明

圖1為熊果酸的¹HNMR譜圖；

圖2為熊果酸的¹³CNMR譜圖；

圖3為熊果酸的ESI-MS譜圖；

圖4為熊果酸的液相色譜分析結果；

圖5UA對R-HepG2細胞的增殖抑制作用。

圖6為熊果酸作用于耐藥株細胞R-HepG2的細胞周期圖。

圖7為熊果酸不同時間、不同濃度作用于乳腺癌Bcap37的AnnexinV-PI雙染凋亡圖。

圖8為加入caspase抑制劑后熊果酸對耐藥株細胞R-HepG2凋亡誘導率的柱狀圖；

圖9為為熊果酸引起耐藥株細胞R-HepG2凋亡的熒光圖。

圖10為加入或不加入caspase抑制劑，熊果酸對R-HepG2細胞線粒體膜電位的作用結果。