[發(fā)明專利]一種用磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010204923.0
• 申請日: 2010-06-11
• 公開（公告）號: CN101845435A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 胥傳來;屈昌龍;劉微波;勇倩倩;趙媛;徐麗廣;林菲
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA的方法，屬于納米材料和分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

目前轉(zhuǎn)基因食品對人類的影響主要歸結(jié)為外源基因在受體中的表達安全性，以及基因逃逸所造成的基因污染問題。國際上對轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)可以分為兩類：一種是以表達蛋白為目標的檢測方法，一種是以外源DNA為目標的檢測方法。以外源DNA為目標的檢測方法包括DNA雜交法和聚合酶鏈式反應法(polymerase?chain?reaction，PCR)。應用DNA雜交法和聚合酶鏈式反應法，首先要得到基因組DNA。

目前，廣泛用于轉(zhuǎn)基因大豆DNA的提取方法主要有CTAB法和SDS法。CTAB法和SDS法提取過程中要用到大量有毒的有機試劑，而且操作步驟繁瑣，耗時間，這已經(jīng)不能達到現(xiàn)代檢測對快速、準確、方便的要求。因此有必要發(fā)明一種新的轉(zhuǎn)基因大豆DNA的提取方法，國內(nèi)目前尚未見有利用磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA方面的報道，本發(fā)明彌補了這一空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種快速、準確、操作簡便、用時短的轉(zhuǎn)基因大豆DNA的提取方法，為DNA雜交和聚合酶鏈式反應(PCR)提供方便的途徑。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種用磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA的方法，包括磁性納米粒子制備，磁性納米粒子與轉(zhuǎn)基因大豆DNA提取液混合，加入聚乙二醇PEG-NaCl緩沖液，用磁鐵將吸附了轉(zhuǎn)基因大豆DNA的磁性納米粒子與溶液分離，用70％乙醇清洗吸附了轉(zhuǎn)基因大豆DNA的磁性納米粒子，用TE緩沖液洗脫磁性納米粒子上的轉(zhuǎn)基因大豆的DNA。

工藝步驟為：

(1)磁性納米粒子聚集體的制備：

①稱取一定量的無水三氯化鐵(0.65g)和檸檬酸三鈉(0.4g)，加入乙二醇(20mL)作為溶劑，驅(qū)除氧氣，磁力攪拌使之全部溶解；

②稱取一定量的無水乙酸鈉(1.2g)加入到反應體系中，繼續(xù)攪拌，置于反應釜中油浴加熱至220℃，同時磁力攪拌，反應一段時間(10h)后停止加熱，繼續(xù)磁力攪拌冷卻至室溫；

③反應后的溶液加入二倍體積的無水乙醇，超聲震蕩10min，6000rpm離心10min，棄上清；

④沉淀部分繼續(xù)加入步驟③相同體積的無水乙醇，超聲震蕩10min，6000rpm離心10min，棄上清；

⑤沉淀部分加入去離子水(10mL)，超聲震蕩10min，6000rpm離心10min，棄上清；

⑥沉淀分散于適量去離子水(10mL)中，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)用磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆DNA

①用粉碎機將轉(zhuǎn)基因大豆粉碎；

②稱量一定量的轉(zhuǎn)基因大豆粉末(50mg)，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，分兩次加入65℃預熱的DNA提取緩沖液(0.5M?Tris-HCl，0.5M?NaCl，50mM?EDTA，4％SDS，pH8.0)進行提取，每次加入350μL，渦旋震蕩混合均勻，65℃水浴30min，期間顛倒離心管數(shù)次；第一次提取后離心分離，沉淀部分進行第二次提取，提取后離心分離，棄沉淀；兩次提取液合并。

③合并后的提取液10000rpm離心10min，取上清，加入15μL磁性納米粒子，再加入PEG-NaCl(30％PEG-6M?NaCl)緩沖液，使溶液中NaCl的終濃度為2M，室溫下靜置10min；

④用磁鐵將吸附有轉(zhuǎn)基因大豆DNA的磁性納米粒子與溶液分離，去上清；

⑤用500μL質(zhì)量濃度70％乙醇清洗吸附有轉(zhuǎn)基因大豆DNA的磁性納米粒子兩次，37℃烘箱烘干；

⑥加入適量(50μL)TE(50mM?Tris-HCl，10mM?EDTA，pH8.0)緩沖液，65℃水浴孵育5min，混勻后用磁鐵吸附磁性納米粒子，取上清，即為轉(zhuǎn)基因大豆DNA溶液。保存于-22℃，備用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用合成的磁性納米粒子提取轉(zhuǎn)基因大豆的DNA，相比傳統(tǒng)的DNA提取方法，操作簡單，耗時短，提取的轉(zhuǎn)基因大豆DNA完全可以用于DNA雜交和PCR等實驗，為以后的研究分析提供了便利。

附圖說明

圖1磁性納米粒子的TEM(透射電鏡)圖。

圖2磁性納米粒子提取的轉(zhuǎn)基因大豆DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

(1)磁性納米粒子聚集體的制備：

①稱取0.65g無水三氯化鐵和0.4g檸檬酸三鈉，加入20mL乙二醇作為溶劑，驅(qū)除氧氣，磁力攪拌使之全部溶解；