[發明專利]一種運用PCR-DHPLC檢測沙門氏菌的方法

無效

• 申請號: 201010204906.7
• 申請日: 2010-06-11
• 公開（公告）號: CN101921838A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 胥傳來;勇倩倩;陳偉;劉微波;徐麗廣;趙書閣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02;C12R1/42
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種運用PCR-DHPLC檢測沙門氏菌的方法，其特征在于包括沙門氏菌培養，磁性納米粒子的制備，沙門氏菌基因組DNA的提取，沙門氏菌特異性引物的選擇，PCR擴增，PCR產物的DHPLC檢測；工藝步驟為：

(1)沙門氏菌培養：

將沙門氏菌菌株一環接種于10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，于36℃培養10h；

(2)磁性納米粒子的制備：

制備羧基修飾的磁性納米粒子，用于吸附沙門氏菌基因組DNA；

①取0.65g?FeCl₃，0.4g檸檬酸三鈉，和20mL乙二醇，攪拌反應10min；

②取1.2g醋酸鈉加入步驟①所得溶液中，攪拌反應20min；

③將步驟②所得溶液在220-230℃下攪拌反應10h；

④向步驟③所得溶液中加入20mL無水乙醇，超聲10min，6000rpm離心10min，去上清；

⑤向步驟④所得沉淀中加入20mL去離子水，超聲10min，6000rpm離心10min，去上清；

⑥向步驟⑤所得沉淀中加入5mL去離子水，得到粒徑為350nm的磁性納米粒子，備用；

(3)沙門氏菌基因組DNA的提取：

①取(1)中增菌液1mL，10000rpm離心5min，去除上清；

②將步驟①所得沉淀用1mL?TE緩沖液溶解，加入100μL?10％十二烷基磺酸鈉SDS；

所用TE緩沖液組成為：含50mM?Tris-HCl和10mM乙二胺四乙酸EDTA的溶液，pH8.0；

③向步驟②所得溶液中加入20μL制備的磁性納米粒子；

④向步驟③所得溶液中加入370μL質量濃度30％PEG?6000-6mol/L?NaCl混合液，室溫反應15min；

⑤將步驟④所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑥向步驟⑤所得磁性納米粒子中加入1mL質量濃度70％乙醇；

⑦將步驟⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；

⑧向步驟⑦所得磁性納米粒子中加入100μL?TE緩沖液溶解，65℃反應10min，此時所用TE緩沖液組成為：含10mM?Tris-HCl和1mM?EDTA，pH8.0；

⑨將步驟⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，即為沙門氏菌基因組DNA；

(4)設計沙門氏菌特異性引物：

上游引物S1為：5’-CTG?CCG?CAG?TGT?TAA?GGA?TA-3’，

下游引物S2為：5’-CTG?TCG?CCT?TAA?TCG?CAT?GT-3’；

(5)以得到的沙門氏菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增：

取沙門氏菌基因組DNA模板1μL，分別加入濃度10μM的引物S1、S2各1μL，濃度20μM的dNTP?1μL，酶活5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCR?Buffer5μL，加水補足到50μL，把各組分加到0.2mL的PCR反應管中，按下列參數進行PCR循環；

預變性：94℃3min；

進入循環：94℃變性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，循環擴增35次；

終止延伸：72℃10min；

4℃保存PCR擴增產物；

(6)PCR產物的DHPLC檢測：將獲得的PCR擴增產物進行DHPLC檢測，從而達到檢測沙門氏菌的目的；

色譜柱：PS-DVB?&?C18DNA?Sep色譜柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱溫：50℃；

流動相：體積比：緩沖溶液A濃度為50.2％，緩沖溶液B濃度為49.8％，其中，緩沖溶液A是濃度0.1mM的乙酸三乙胺TEAA水溶液，緩沖液B是濃度0.1MTEAA與乙腈按照體積比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

檢測器：熒光檢測器：光源：150W?Xenon燈；激發譜帶寬：15nm；發射譜帶寬：15.3nm；檢測靈敏度：在波長350nm積分2s；

上樣量：PCR擴增產物5μL。