[發(fā)明專利]一種原核表達載體及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010204835.0
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN101967493A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭禮飛;楊陳;殷環(huán);鄧莉;甘偉瓊;廖淑莉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N1/21;C12P21/00;C12P21/02;C07K1/22;C07K1/16;C12R1/19
• 代理公司: 湛江市三強專利事務(wù)所 44203
• 代理人: 龐愛英

1.一種原核表達載體，其特征在于含有：

(a)促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊的分子伴侶的編碼核苷酸序列；

(b)能在C末端肽鍵斷裂的內(nèi)含肽的編碼核苷酸序列。

2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達載體，其特征在于，宿主細胞是大腸桿菌。

3.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達載體，其特征在于，所述分子伴侶能促進目標蛋白可溶性表達或/和二硫鍵正確折疊，使表達的目標蛋白保持有天然生物活性；所述內(nèi)含肽能在一定條件下被有效誘導(dǎo)C末端的肽鍵裂解，使目標蛋白與融合蛋白分離。

4.據(jù)權(quán)利要求3所述的一種原核表達載體，其特征在于，所述分子伴侶包括硫氧還蛋白、二硫鍵還原酶及異構(gòu)酶、小泛素修飾蛋白、NusA及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶；所述的內(nèi)含肽包括mini?Ssp?DnaB、Sce?VMA等，以選用mini?Ssp?DnaB為佳。

5.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原核表達載體的應(yīng)用，其特征在于，表達的目標蛋白是具有生物活性的蛋白或多肽，特別是含有二硫鍵的生物活性蛋白或多肽，包括鉤蟲抗凝肽及其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物。

6.據(jù)權(quán)利要求2所述的一種原核表達載體，其特征在于，一種宿主細胞包含有權(quán)利要求5所述的載體。

7.據(jù)權(quán)利要求5所述的一種原核表達載體的應(yīng)用，其特征在于，目標蛋白與融合蛋白有效分離是在0℃～40℃下，較佳在0℃～20℃下，pH為6.0～8.0的緩沖液中進行。

8.據(jù)權(quán)利要求7所述的一種原核表達載體的應(yīng)用，其特征在于，從融合蛋白中分離出來的目標蛋白的分離、純化方法包括用親和層析純化融合有親和標簽，如帶His-tag的目標蛋白，或用制備的抗體親和純化目標蛋白，或根據(jù)目標蛋白的理化性質(zhì)進行層析純化。

9.據(jù)權(quán)利要求5所述的一種原核表達載體的應(yīng)用，其特征在于，

(a)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細胞；

(b)據(jù)權(quán)利要求7所述條件下，進行目標蛋白與融合蛋白的有效分離；

(c)據(jù)權(quán)利要求8所述方法進行目標蛋白的分離與純化。

10.據(jù)權(quán)利要求5一種原核表達載體的應(yīng)用，其特征在于，目標蛋白包括由SEQ?ID?NO.1氨基酸序列組成的多肽或其保守性變異多肽、或它們的活性片段、或它們的活性衍生物。