[發明專利]微生物催化法制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株

有效

• 申請號: 201010204535.2
• 申請日: 2010-06-21
• 公開（公告）號: CN101886096A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 鄭裕國;林志堅;鄭仁朝;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種微生物催化法制備2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺的方法，所述方法包括：在以2-氨基-2，3-二甲基丁腈為底物，以慶笙紅球菌(Rhodococcusqingshengii)CCTCC?No：M?2010050、小球諾卡氏菌(Nocardia?globerula)CCTCC?No：M?209214或紅平紅球菌(Rhodococcus?erythropolis)CCTCCNo：M?209244發酵產生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6.0～10.0、20～40℃下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述反應在水或pH6.0～10.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進行

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述反應體系中底物初始濃度為0.03～0.3M。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自慶笙紅球菌CCTCC?No：M?2010050、小球諾卡氏菌CCTCC?No：M?209214或紅平紅球菌CCTCC?No：M?209244經發酵獲得的含酶菌體細胞，所述含酶菌體細胞在反應體系中添加量以含酶細胞濕重計為5～50g/L。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細胞由如下方法制備得到：

(1)將經斜面活化的慶笙紅球菌CCTCC?No：M?2010050、小球諾卡氏菌CCTCC?No：M?209214或紅平紅球菌CCTCC?No：M?209244接入種子培養基中，于20～40℃下培養24～48h，獲得種子液；

所述種子培養基終濃度組成如下：葡萄糖5～20.0g/L，酵母浸出粉2～8.0g/L，蛋白胨1～4.0g/L，KH₂PO₄0.5～1.5g/L，K₂HPO₄0.5～1.5g/L，NaCl?0.5～3.0g/L，己內酰胺0.5～2.0g/L，MgSO₄0.05～0.2g/L，CoCl₂0.01～0.05g/L，FeSO₄0.01～0.05g/L，溶劑為水，pH?6.0～8.0；

(2)將種子液以1～10％體積比接入產酶培養基中，于20～40℃下培養48～96h，培養得到的發酵液經離心或膜分離，得所述含酶菌體細胞；所述產酶培養基終濃度組成如下：蔗糖5.0～10.0g/L，檸檬酸鈉2.0～5.0g/L，牛肉膏2.0～8.0g/L，酵母粉2.0～8.0g/L，氯化鈉0.5～2.0g/L，磷酸二氫鉀0.5～2.5g/L，氯化鈷0.005～0.01g/L，氯化鐵0.005～0.01g/L，氯化錳0.005～0.01g/L，誘導劑1.0～3.0g/L，溶劑為水，pH?6.0～8.0；所述誘導劑為下列之一：谷氨酸鈉、2，2-二甲基環丙甲酰胺、己內酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。

6.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下：將所述含酶菌體細胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6.0～10.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈至底物濃度為0.03～0.3M，于15～40℃、100～200rpm下反應10～60min；反應結束后，轉化液經分離純化得到所述2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下：反應結束后，取轉化液12000rpm離心10min，收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉入旋轉蒸發儀，在真空度-0.1Mpa，水浴加熱溫度40～60℃、轉速60～100rpm條件下減壓蒸發除去底物2-氨基-2，3-二甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺粗品溶于20～65℃的乙酸乙酯，加入體積為乙酸乙酯體積10％鹽析劑正己烷，于0～4℃保溫結晶；過濾，取濾渣用正己烷洗滌，干燥得到2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺晶體。