[發(fā)明專利]水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010203879.1
• 申請(qǐng)日: 2010-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN102286391A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆喜軍;白雪;柴秀麗;羅國良;趙建軍;張海玲;邵西群;張蕾;高晗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所;閆喜軍
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;A61K39/116;A61K39/104;A61P11/00;A61P31/04;C12R1/385
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

水貂出血性肺炎又稱水貂假單胞菌性肺炎，是主要發(fā)生在每年9～11月份水貂換毛季節(jié)的一種急性傳染病，以出血性肺炎、急性死亡為特征，死前出現(xiàn)呼吸困難、鼻孔流出紅色帶泡沫液體等癥狀，死后剖檢可見整個(gè)肺葉彌漫性出血和敗血癥變化。本病世界各地均有發(fā)生，每年可造成養(yǎng)殖場(chǎng)10％～50％的死亡率，是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的重要細(xì)菌性傳染病。

該病病原為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseud-omonas)中的銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginolsa)，亦稱為綠膿桿菌(Bacterium?pyocyaneum)，為革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)1.5～3.0μm，寬0.5～0.7μm，兩端鈍圓，一端有一根鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。不能形成芽胞及莢膜。在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成大小不一的菌落。多數(shù)能產(chǎn)生藍(lán)綠色水溶性色素，使菌落周圍瓊脂培養(yǎng)基著色。

綠膿桿菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，在正常人與動(dòng)物腸道和皮膚上亦有存在，也易從外傷、燒傷及尿道感染等發(fā)現(xiàn)，能引起人的燒傷感染和患囊性纖維化病人的肺部感染，具有多種致病因子而且有強(qiáng)侵襲力，因此認(rèn)為本菌并非潛在致病菌而是完全致病菌。

水貂出血性肺炎發(fā)病急，死亡快，發(fā)病時(shí)往往來不及治療，常用藥物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治療效果不顯著，而且抗生素的濫用導(dǎo)致綠膿桿菌已產(chǎn)生極強(qiáng)的耐藥性，因此需要有效的疫苗來預(yù)防，國內(nèi)尚無商品化的疫苗來預(yù)防水貂出血性肺炎，國外有報(bào)道將細(xì)菌細(xì)胞壁提取物(JAMES?E.PENNINGTON，1979)，和從菌體內(nèi)提取的共同保護(hù)性抗原OEP(common?protective?antigen)(ABEC，1975；E.HONDA，1976)加類毒素成分彈性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制備過程復(fù)雜，成本高，不適合大量生產(chǎn)使用，而且免疫次數(shù)多，免疫期短，不適合臨床應(yīng)用，綠膿桿菌抗原型繁多，單一成分的細(xì)胞提取物往往很難達(dá)到很好的保護(hù)效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供兩種血清型銅綠假單胞菌強(qiáng)毒株以及由該兩種強(qiáng)毒株制備的水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗，所述水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗預(yù)防水貂出血性肺炎，預(yù)防免疫效果佳，安全性好。

本發(fā)明提供的一種銅綠假單胞菌菌株DL15，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.3811。

本發(fā)明提供的另一種銅綠假單胞菌菌株JL08，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.3812。

用Reed-Muench法測(cè)定這兩株毒株對(duì)小白鼠的半數(shù)致死量(LD50)，菌株DL15的LD50為250萬CFU，菌株JL08的LD50為2000萬CFU；菌株DL15對(duì)水貂的半數(shù)致死量(LD50)為100萬CFU，菌株JL08的LD50為250萬CFU。

本發(fā)明還提供由上述銅綠假單胞菌菌株制備的水貂出血性肺炎疫苗。

所述的水貂出血性肺炎疫苗，作為優(yōu)選，為二價(jià)滅活疫苗。

本發(fā)明還提供一種水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：

步驟1：將銅綠假單胞菌菌株DL15和銅綠假單胞菌菌株JL08分別接種于PYG培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整菌數(shù)為80-100億CFU/mL按比例1-2∶1混合；

步驟2：滅活步驟1所得混合培養(yǎng)物；

步驟3：在步驟2所得培養(yǎng)物中添加防腐劑和佐劑，即得所述水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗。

作為優(yōu)選，步驟1所述接種為按PYG培養(yǎng)基體積的3-4％接種菌株。

作為優(yōu)選，步驟1所述培養(yǎng)為在37℃通氣培養(yǎng)12-15h，控制綠膿桿菌的培養(yǎng)時(shí)間在15h以內(nèi)，防止培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致綠膿桿菌外毒素的產(chǎn)生，更好地保障疫苗安全性。

作為優(yōu)選，步驟2所述滅活為用終濃度0.15％的甲醛滅活。更優(yōu)選地，于37℃滅活24h，期間振搖2～3次。

作為優(yōu)選，步驟3所述防腐劑為疊氮鈉，優(yōu)選終質(zhì)量濃度為0.01％。

作為優(yōu)選，步驟3所述佐劑為氫氧化鋁溶液，優(yōu)選氫氧化鋁溶液體積為培養(yǎng)液的4％。

本發(fā)明所述銅綠假單胞菌菌株DL15和菌株JL08混合制成的水貂出血性肺炎二價(jià)滅活疫苗，一次可達(dá)到80％以上保護(hù)率，免疫期可達(dá)到五個(gè)月，可有效預(yù)防目前國內(nèi)流行的水貂出血性肺炎，其制備工藝簡(jiǎn)單，適合商品化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

生物保藏信息：