[發明專利]藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法

無效

• 申請號: 201010201827.0
• 申請日: 2010-06-12
• 公開（公告）號: CN101906412A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 于鴻浩;趙新全;郭志林;郭松長;曹俊虎;徐世曉
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12N15/06
• 分類號: C12N15/06
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

1.一種藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，包括以下步驟：

(1)供體細胞和受體細胞的選擇：供體細胞選擇藏羚羊成纖維細胞，并將其培養在24孔板中；受體卵母細胞選擇山羊、牦牛、黃牛或奶牛卵母細胞中的任意一種；

(2)制作體積為25μL的融合微滴；

(3)供體細胞與受體卵母細胞的融合：依次將受體卵母細胞移至T20、植物血凝素、T2B、融合液微滴內進行操作，形成兩個卵母細胞夾雜一個供體細胞的復合體；將復合體移至融合液內平衡2～3min后，再至融合槽內進行電融合即可。

2.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特征在于：所述步驟(3)中的T20是由占總溶液體積的20％的胎牛血清和80％的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調節pH值至7.2～7.4的溶液；其中雙抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。

3.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特征在于：所述步驟(3)中的植物血凝素是由5mg植物血凝素溶于5mL?TCM199基礎培養液中所得的溶液。

4.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特征在于：所述步驟(3)中的T2B是指在TCM199基礎培養液中加入總溶液體積的2％的胎牛血清和8mg/mL牛血清白蛋白所得的溶液。

5.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特征在于：所述步驟(3)中的融合液是指先用20mL蒸餾水溶解0.025g?MgSO₄，過濾保存；再用20mL蒸餾水溶解0.0147g?CaCl₂·2H₂O，過濾保存；將10.93g甘露醇和0.2g聚乙烯醇充分溶解于196mL蒸餾水中，然后向其分別加入2mL預先配制好的MgSO₄和CaCl₂·2H₂O溶液，過濾后即得。

6.如權利要求1所述的藏羚羊成纖維細胞與受體卵母細胞的化學輔助融合方法，其特征在于：所述步驟(3)中的電融合的條件是交流電場7V，脈沖電場70V，持續時間20μs，持續兩次，每次間隔0.1s。