[發明專利]一種具有抗Cd2+和抗Cu2+功能的基因DvCRP1、其編碼蛋白及應用

有效

• 申請號: 201010201434.X
• 申請日: 2010-06-12
• 公開（公告）號: CN101921778A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 宋任濤;許政暟;孟祥宗
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C07K14/405
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

1.一種具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP1，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO：1所示的堿基序列；

2)與SEQ?ID?NO：1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同生物學功能蛋白質的DNA序列。

2.一種根據權利要求1所述DvCRP1基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具有下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列；

2)通過將SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而產生的衍生蛋白質的氨基酸序列，該衍生蛋白質與SEQ?ID?NO：2的蛋白具有相同的生物學功能。

3.一種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權利要求1所述的DvCRP1基因。

4.一種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞含有權利要求3所述的重組載體。

5.一種根據權利要求1所述的DvCRP1基因在提高生物抗鎘和抗銅能力基因工程方面的應用。

6.一種根據權利要求1所述的DvCRP1基因在提高生物鎘和銅積累量基因工程方面的應用。

7.一種根據權利要求2所述的DvCRP1基因編碼的蛋白在提高生物抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能方面的應用。

8.一種根據權利要求2所述的DvCRP1基因編碼的蛋白在增加生物體內鎘和銅的積累量方面的應用。

9.一種克隆權利要求1所述具有抗Cd²⁺和抗Cu²⁺功能的基因DvCRP1的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

a)將酵母表達文庫通過LiAc熱擊法轉化酵母突變體Δyap1，在150μM?Cd²⁺的篩選壓力下篩選突變表型回復的酵母轉化子，得到候選克隆；

b)將步驟a)得到的候選克隆所攜帶的表達載體從酵母細胞中分離出來，轉化大腸桿菌進行擴增；把擴增以后的載體回轉酵母突變體Δyap1，得到在150μM?Cd²⁺的脅迫處理下仍能夠正常生長的陽性克隆；

c)利用限制性內切酶EcoRI/XhoI消化步驟b)得到的陽性克隆釋放出插入片段，構建到測序載體中，通過測序獲得DvCRP1基因的部分cDNA序列；

d)在步驟c)得到的部分cDNA序列上設計兩條5’RACE引物，引物序列分別為：

5’-gcggctcgtgacgccacactcagacagg-3’

5’-gtggcacagcctgtctcccgagctacag-3’，

使用SMART^TM?RACE?cDNA?amplification?kit試劑盒進行5’cDNA擴增反應，回收最長的擴增產物連接到測序載體上，通過測序獲得鹽藻DvCRP1基因的全長編碼序列。