[發明專利]文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用

無效

• 申請號: 201010201257.5
• 申請日: 2010-06-04
• 公開（公告）號: CN101921788A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 劉保忠;岳欣;郇聘;王鴻霞
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/36;A01N63/02;A01P1/00;A61K38/47
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及分子生物學，具體的說是一種文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用。

背景技術

溶菌酶能夠催化水解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰葡聚糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，從而導致細胞的裂解，達到殺菌的目的。已發現的溶菌酶分為不同的型，在動物中存在C型(雞卵清溶菌酶)、G型(鵝卵清溶菌酶)和I型(無脊椎動物型)，其分布非常廣泛。溶菌酶在生物體免疫防御體系中發揮作用，尤其對于缺少獲得性免疫的貝類，在抵御外來細菌入侵時有著舉足輕重的作用。另外，也有報道指出溶菌酶可以作為貝類的一種消化酶，通過分解濾食到的細菌，貝類可以得到自身所需的營養。

隨著海水養殖行業的發展，養殖環境的污染、養殖病害頻發等問題備受人們關注，傳統的利用抗生素控制的辦法受到了越來越多的質疑，而且也不適用于開放的海水養殖環境，開發新的有效的免疫增強劑就成為亟待解決的問題。來源于水產動物本身的溶菌酶作為一種天然無毒的酶制劑，為這一問題的解決帶來了曙光，可以作為備選的新型免疫增強劑。由于人體細胞沒有細胞壁成分，溶菌酶對人體沒有毒副作用，對環境的壓力也遠小于抗生素。另外，溶菌酶作為一種天然的免疫增強劑、防腐劑、抗菌劑，已經廣泛地被應用到食品、醫藥衛生和飼料行業中，例如奶粉添加劑、水產品保鮮防腐劑、飼料添加劑、去除原生質層，等等。其應用前景非常廣泛。

文蛤是一種在沿海和灘涂地區廣泛分布的雙殼貝類(Wang?et?al.，1993)。在我國沿海，文蛤作為一種重要的經濟貝類而被廣泛養殖(Liu?et?al.，2006)。目前，還沒有從文蛤中獲得溶菌酶基因的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種文蛤溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

文蛤I型溶菌酶基因，其是從文蛤中克隆得到的溶菌酶的cDNA序列，該序列全長552bp，其中完整閱讀框441bp，5′非編碼區15bp，3’非翻譯區96bp，有多聚賴氨酸加尾信號(AATAA)和多聚賴氨酸尾巴。該基因在文蛤防御中發揮著重要作用，具體為序列表SEQ?ID?NO.1中堿基序列所示。所得溶菌酶基因利用pGEX-4T-1表達載體在大腸桿菌BL21中重組表達了該蛋白，表達產物具有抑菌活性。

其編碼的蛋白具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列，完整編碼蛋白含有146個氨基酸，其中編碼序列的1-15個氨基酸為信號肽序列，成熟肽包括131個氨基酸，其中含有14個半胱氨酸，預測分子量為14.6kDa。成熟肽具有典型的失穩酶超家族結構域(Destabilase?superfamily)。

本發明利用構建cDNA文庫，采用RACE技術以及體外重組表達技術，克隆到溶菌酶基因cDNA全長序列。通過PCR技術，擴增編碼溶菌酶成熟肽的基因片斷并將其克隆到pGEX-4T-1表達載體中，在大腸桿菌中重組表達了該蛋白。重組產物經過GSTrap?FF親和柱純化以及凝血酶切掉GST融合蛋白后，獲得了溶菌酶重組蛋白，經檢測此重組蛋白具有較高的抑菌活性，能起到天然蛋白的功能，具有大規模生產的可能，可以彌補天然蛋白量低以致難以滿足需要的局限。

附圖說明

圖1為本發明實施例純化的文蛤溶菌酶重組蛋白，其中M：蛋白marker；1：帶有GST標簽的文蛤溶菌酶重組蛋白；2：用凝血酶切下的GST標簽蛋白；3：切掉GST標簽的文蛤溶菌酶重組蛋白。

圖2為本發明實施例獲得文蛤溶菌酶重組蛋白對藤黃微球菌(革蘭氏陽性菌)的抑菌效果圖。

圖3為本發明實施例獲得文蛤溶菌酶重組蛋白對銅綠假單胞菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌效果圖。

具體實施方式

下面的實施例中將本發明作進一步闡述，但本發明不限于此。

實施例1.

一種克隆得到的文蛤溶菌酶基因，具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。

本發明中的文蛤溶菌酶的cDNA序列克隆包括下列步驟：

a)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；

b)文蛤cDNA文庫構建；

c)文蛤cDNA文庫EST序列的大規模測定；

d)文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的篩選；

e)RACE擴增獲得文蛤溶菌酶的全序列以及全序列的驗證。

具體操作如下：

1.文蛤總RNA的提取及mRNA的純化：利用Invitrogen公司的Trizol試劑從文蛤幼蟲中提取總RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA純化試劑盒純化mRNA。