[發(fā)明專利]一種基于超濾濃縮的從大體積尿液樣品中提取microRNA的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010201168.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN102277352A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王展林;申河清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從大體積尿液樣品中提取microRNA的方法。?

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是一種21-25nt長(zhǎng)的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)。已有的研究表明一些miRNA的異常表達(dá)與一些疾病或癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而且研究發(fā)現(xiàn)miRNA不但在組織細(xì)胞中存在，在一些體液如血清、血漿及尿液中也穩(wěn)定存在，因此，miRNA有望成為一類檢測(cè)或預(yù)測(cè)一些疾病或腫瘤的重要生物標(biāo)志物。?

檢測(cè)miRNA常用的技術(shù)方法是基因芯片和熒光定量PCR，但是這些技術(shù)方法的應(yīng)用前提是對(duì)組織、細(xì)胞或體液進(jìn)行核酸提取、純化后獲得miRNA。尿液樣品由于獲得方便、避免了機(jī)體損傷等原因已成為最理想的候選樣品，但是由于單位體積尿液中的miRNA含量很低，目前市售的提取試劑盒能夠處理尿液樣品量較小，無法達(dá)到一些大規(guī)模篩選或表達(dá)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)要求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種可以從大體積尿液樣品中成功提取miRNA的實(shí)驗(yàn)方法，以獲得純度和產(chǎn)量均達(dá)到適用于一些大規(guī)模篩選或檢測(cè)表達(dá)的miRNA。?

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種穩(wěn)定劑的配方，該穩(wěn)定劑不僅能夠穩(wěn)定尿液中的miRNA不被降解，而且能夠裂解尿液中的脫落細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的miRNA釋放出來。?

本發(fā)明的穩(wěn)定劑在尿液樣品獲得之后立即加入，自然溶解后保存于-80℃冰箱，可保持miRNA穩(wěn)定，不被降解。?

本發(fā)明尿液前處理步驟一中經(jīng)穩(wěn)定處理的尿液的pH值接近7.0，穩(wěn)定劑在尿液樣品中異硫氰酸胍的濃度為6mol/l，N-月桂酰基肌氨酸的濃度為0.5mol/l，無水乙酸鈉的濃度為0.025mol/l，HEPES的濃度為0.5mol/l，尿液樣品終體積為30ml。?

通過采用超濾管(Amicon?Ultra-15?3K，millipore)，可將1-30ml的尿液樣品濃縮至1ml左右，通過酚/氯仿萃取，再采用市售的試劑盒(miRNeasy?Mini?Kit，Qiagen)抽提，可獲得質(zhì)量、產(chǎn)量符合要求的miRNA。?

本發(fā)明從大體積尿液樣品中提取miRNA的原理和優(yōu)點(diǎn)：1.對(duì)尿液樣品進(jìn)行降解酶抑制處理，可長(zhǎng)時(shí)間保存尿液樣品，適合長(zhǎng)距離運(yùn)輸而游離miRNA片段不被降解；2.采用超濾濃縮裝置對(duì)尿液樣品進(jìn)行濃縮，減少了氯仿、苯酚等有毒試劑的使用量，減少了污染，同時(shí)由于樣品體積的減小，縮短了核酸片段吸附捕獲的時(shí)間，減小了片段被降解的風(fēng)險(xiǎn)；3.使用氯仿和Tris飽和酚混合溶液抽提，可以有效去除尿液樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；4.綜上所述，本發(fā)明克服了尿液樣品保存過程中miRNA片段降解的問題，克服了大體積尿液樣品難以處理的問題，能夠獲得產(chǎn)量、質(zhì)量均達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求miRNA；5.本發(fā)明同樣適用于含有組織脫落細(xì)胞的尿液。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述方法所提取miRNA的熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)曲線圖?

圖2為實(shí)施例2所述方法所提取miRNA的熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)曲線圖?

具體實(shí)施方式

通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。?

[實(shí)施例1]?

利用本發(fā)明方法提取尿樣中游離miRNA并檢測(cè)表達(dá)。?

尿液樣品一份為隨機(jī)獲取，采樣對(duì)象健康狀況未知，具體實(shí)施過程如下：?

(1)尿液樣品(30ml)獲得后立即加入一定量的穩(wěn)定劑，自然溶解后保存于-80℃或直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。?

(2)采用超濾管(Amicon?Ultra-15?3K，millipore)將尿液樣品濃縮至1ml左右，用Tris飽和酚∶氯仿(1∶1)萃取，取上清。再采用市售的試劑盒(miRNeasy?Mini?Kit，Qiagen)抽提，獲得miRNA。?

(3)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScript?Reverse?Transcription?Kit，Qiagen)對(duì)獲得的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃60min；95℃5min。?