[發(fā)明專利]隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010200117.6
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN102276725A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳兆國;李艷;米榮升;黃燕;周鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;A61K48/00;A61K39/002;A61P33/02
• 代理公司: 上海大邦律師事務(wù)所 31252
• 代理人: 周東萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲病，可以感染包括人類在內(nèi)的哺乳類、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類等170多種動物。對免疫功能正常的宿主可引起自限性腹瀉，對免疫功能受損的宿主則呈慢性腹瀉并常常危及生命，給人類健康和生命安全帶來了嚴(yán)重威脅，也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的損失。隱孢子蟲最先由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺粘膜組織切片中發(fā)現(xiàn)。其中，微小隱孢子蟲(Cryptosporidium?parvum)是最主要的人獸共患病病原。迄今為止，研究人員已在實(shí)驗(yàn)室篩選了上千種化學(xué)藥物和抗生素，仍未找到理想的抗隱孢子蟲藥物。因此隱孢子蟲病的免疫預(yù)防和治療就顯得十分重要，但目前仍缺乏有效的隱孢子蟲病預(yù)防疫苗。

在以往的隱孢子蟲疫苗研究中，人們通常在重組疫苗中編碼一個全長的隱孢子蟲抗原蛋白。但是，此類單一的疫苗候選分子的免疫保護(hù)效果并不理想，其原因可能是隱孢子蟲基因組巨大，生活史復(fù)雜，抗原種類繁多，單一的抗原無法徹底阻斷病原在宿主體內(nèi)的生活周期，導(dǎo)致單一抗原、單一表位的免疫保護(hù)效果不夠理想。考慮使用多抗原疫苗時，由于載體容量有限，并且大分子蛋白可能會造成動物免疫病理反應(yīng)，所以在單一載體中加入多個抗原存在很大的局限性。近年來，國際寄生蟲學(xué)界開始嘗試?yán)每乖砦活A(yù)測工具進(jìn)行抗原表位預(yù)測，構(gòu)建多表位疫苗(multi-epitope?vaccine)，多表位疫苗也稱雞尾酒式疫苗，是同時攜帶多個與目標(biāo)抗原相關(guān)的表位及輔助性表位的疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，多表位疫苗具有獨(dú)特的優(yōu)勢，能被多種遺傳背景的主要組織相容性復(fù)合體(major?histocompatibility?complex，MHC)分子所識別、結(jié)合，從而得到高效的遞呈，尤其在細(xì)胞免疫方面具有顯著的優(yōu)勢，以應(yīng)對病原微生物的變異以及免疫反應(yīng)中諸多的不利因素。在抗瘧疾多表位疫苗研制領(lǐng)域，已設(shè)計合成了多個基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了較好的免疫保護(hù)效果，其中不少已進(jìn)入Ⅱ期或Ⅲ期臨床試驗(yàn)。在隱孢子蟲領(lǐng)域目前尚無這方面的報道。

為使機(jī)體獲得最佳的免疫保護(hù)，構(gòu)建多表位疫苗時需綜合考慮機(jī)體的免疫應(yīng)答特征和疾病的特殊性，針對性地選擇目的抗原表位。體液免疫主要通過B細(xì)胞產(chǎn)生抗體來發(fā)揮作用，故可以選擇特異性B細(xì)胞表位來定向誘導(dǎo)宿主的體液免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫應(yīng)答包括CD4⁺輔助性T細(xì)胞(helper?T?cell，Th細(xì)胞，分為Th1與Th2兩個亞群)應(yīng)答和CD8⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicT?lymphocyte，CTL)應(yīng)答。因此，可根據(jù)機(jī)體對病原體的免疫應(yīng)答特點(diǎn)，選擇特異性的Th1、Th2或CTL表位來誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答向Th1、Th2或CTL應(yīng)答類型定向發(fā)展。

細(xì)胞免疫在宿主抗隱孢子蟲感染過程中起著至關(guān)重要的作用。研究顯示微小隱孢子蟲初次和再次感染均引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中CD4⁺輔助性T細(xì)胞參與控制感染，CD8⁺細(xì)胞毒性T細(xì)胞則有很強(qiáng)的清除寄生蟲的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決缺少有效的隱孢子蟲多表位疫苗的技術(shù)問題，提供一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白，該混合多表位基因和融合蛋白可用于制備抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。

此外，還需要提供一種隱孢子蟲CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種隱孢子蟲混合多表位融合蛋白，包含：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.3中任意一條或兩條氨基酸序列。

所述SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.3都富含CTL和Th表位，SEQ?ID?NO.1中含有4個CTL表位和2個Th表位，SEQ?ID?NO.3中含有3個CTL表位和1個Th表位。

優(yōu)選的，所述隱孢子蟲混合多表位融合蛋白還包含SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列，該序列中含有4個Th表位。增加SEQ?ID?NO.2序列可適當(dāng)提高免疫肽分子量，以使免疫小鼠產(chǎn)生更高的血清抗體效價、具有更好免疫原性。