[發明專利]中藥注射劑微量蛋白檢測方法

有效

• 申請號: 201010199693.3
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101865926A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 段為鋼;李奇峰;盧國勛
• 申請（專利權）人: 云南中醫學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域

本發明涉及中藥注射劑雜質檢測領域，用于中藥注射劑蛋白質類雜質，以控制中藥注射劑的質量。

技術背景

中藥注射劑最早產生在1946年，由錢信忠等學者開創。在中國醫藥界，中藥注射劑已經廣泛應用于臨床。2005年版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)一部就收錄有燈盞細辛、清開靈、止喘靈及雙黃連等單方和復方注射劑。中藥注射劑在推進中藥劑型發展，拓展中藥的應用范圍，服務廣大人民健康等方面的確功不可沒。安全、有效、質量可控依然是中藥注射劑的基本質量要求。從技術上來講，業界大體上已經解決了中藥注射劑的有效性問題，對于安全性依然是業界難題。

然而，隨著中藥注射劑的廣泛應用于臨床，其不良反應日益暴露，特別是致死性不良反應也屢有報道。根據目前公開的不良反應資料，中藥注射劑的不良反應可以累及各個系統和臟器，甚至導致死亡。很多中藥注射劑的不良反應與原有的藥理作用無關，根據多方面分析，這些不良反應主要屬于過敏反應，即病理性免疫反應，包括I、II、III和IV型病理性免疫反應。因此減少中藥注射劑中的過敏性物質是提高中藥注射劑安全性的關鍵策略之一。

中藥注射劑大多為植物提取物。作為生物提取物，在原料提取過程中會帶來多種植物大分子雜質，如蛋白質、核酸等。盡管植物中的蛋白質含量較低，通過有機溶劑提取的量較少，但微量的蛋白仍足以導致誘發過敏反應。與人相比，植物蛋白與人的同源性差異大，因此常具有很強的抗原性。現行藥典(2010年版)控制中藥注射劑蛋白含量的方法沿用了以前的磺基水楊酸比濁法，控制的蛋白質限量約為37～110μg/ml左右，低于此限量的蛋白藥典方法很難檢出。因此，蛋白含量低于37μg/ml的中藥注射劑將被視為“合格”。而且中藥注射劑中的酸性成分會干擾磺基水楊酸法檢測蛋白的結果，這導致磺基水楊酸法應用范圍受限。而其他未被藥典采用的蛋白質檢測方法如，凱氏(Kjeldahl)定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、直接考馬斯亮蘭法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，卻因為中藥注射劑其他成分或本身顏色帶來嚴重干擾，要么特異性較差，要么靈敏度較差，不適合用于中藥注射劑的蛋白質限量檢測。為了提高安全性，有必要進一步控制中藥注射劑中的蛋白含量，因此建立特異性高并且靈敏的中藥注射劑蛋白質檢測方法很有必要。

由于中藥注射劑都有較深的顏色，成分多樣，而且蛋白質是一類物質，因此很難用目前單一方法同時提高檢測的靈敏性和特異性。因此本發明是針對中藥注射劑的特點而建立的，對蛋白質檢測具有靈敏度高、抗干擾能力強的特點。

發明內容

本發明利用某些膜能將蛋白質特異性高強度吸附的特點以及考馬斯亮藍對蛋白質特異性顯色的特點建立本方法，以提高中藥注射劑微量蛋白檢測的靈敏性和特異性。本方法包括以下三個步驟：

1、先將中藥注射劑樣品點到蛋白特異性吸附膜上；

2、用含有有機溶劑的溶液洗滌點樣膜，以洗去中藥注射劑斑點的本色；

3、將點樣膜進行考馬斯亮藍顯色。

在以上步驟1中，吸附蛋白質的膜包括但不限于硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF膜(Polyvinylidene?fluoride，聚偏二氟乙烯膜)。

在以上步驟2中，采用的有機溶液濃度為0-100％，有機溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有機溶液洗滌的量和洗滌的次數不限，以去除中藥注射劑本色為度。如果中藥注射劑點樣后幾乎無色，本步驟可以跳過直接進入步驟3。

步驟3進行考馬斯亮藍顯色時，考馬斯亮藍的濃度不限?？梢灾苯尤旧?；也可以染色后進行脫色處理，以降低膜的背景。含有一定蛋白質濃度的中藥注射劑會顯示出穩定的藍色。

本方法實施的效果是，檢測的靈敏性和特異性高，抗干擾能力強。

附圖說明

圖1為建立PVDF膜吸附染色檢測蛋白方法，確定本發明檢測限的染色結果圖：a為點樣后風干拍片的結果，b為甲醇洗滌后風干拍片的結果，c為染考馬斯亮藍并脫色后風干拍片的結果，a、b、c中的A組樣品來自標準BSA溶液，用PBS溶液配制，B組為用丹參注射液配制的BSA樣品，從左至右濃度依次均為9mg/ml、3mg/ml、1mg/ml、0.33mg/ml、0.1mg/ml、37μg/ml、12μg/ml、4μg/ml、1.3μg/ml、0μg/ml，點樣量為1μl。