[發明專利]檢測山羊促性腺激素釋放激素和生長分化因子9的堿基突變多態性的方法

無效

• 申請號: 201010199506.1
• 申請日: 2010-06-12
• 公開（公告）號: CN101845507A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 曹斌云;安小鵬;顏泉梅;侯金星;王建剛;宋宇軒;楊明明;朱廣琴;王韻斐;崔易虹;陳秋菊
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種檢測山羊促性腺激素釋放激素基因外顯子4和生長分化因子9基因外顯子2的三個堿基突變多態性的方法，其特征在于，以山羊基因組DNA為模板，在Taq?DNA聚合酶、緩沖環境、Mg²⁺、dNTPs存在的情況下，利用2對引物P1和引物P2在PCR條件下進行擴增，其中，引物P1用于擴增促性腺激素釋放激素基因外顯子4以及部分內含子3和3′非翻譯區，篩查山羊促性腺激素釋放激素基因位點的突變；引物P2用于擴增生長分化因子9的外顯子2，篩查山羊生長分化因子9的外顯子2位點的突變；

根據瓊脂糖凝膠電泳對引物P1和P2的PCR擴增產物進行大小判定，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測引物P1和P2的PCR擴增產物，發現這兩個擴增位點存在3個堿基的突變，其中促性腺激素釋放激素基因外顯子4，包含部分內含子3和3′非翻譯區存在2個基因突變，即185bp處有一個C→T的突變，在336處有一個引起C→T的突變，其中第一個突變在intron?3中，第二處突變在3′UTR；生長分化因子9外顯子2的127bp出有1個A→G的堿基突變，導致第396位氨基酸由纈氨酸變為異亮氨酸；

然后對這兩個基因的SNPs進行基因分型和基因頻率分析，以及與布爾山羊和西農薩能奶山羊的產羔性狀之間進行關聯分析；結果表明：促性腺激素釋放激素基因外顯子4，包含部分內含子3和3′非翻譯區和生長分化因子9基因外顯子2基因由引物P1和P2檢測的SNPs位點可用作山羊產羔性狀選擇的分子標記；

所述的引物P1如下：

上游引物1F：5′-ACCTCTGTCCTCACACCCTA-3′；

下游引物1R：5′-CATTCATGCCATTTTATTCC-3′；

所述的引物P2如下：

上游引物2F：5′-CCATGACTTTAGACTTAGC-3′；

下游引物2R：5′-TGGTTTTACTTGACAGGAG-3′。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的PCR擴增的條件是：12μL反應體系，包括0.25U?Taq?DNA聚合酶，6μL?2×Buffer，0.5μL山羊基因組DNA樣品，10pmol/μL引物P1和引物P2的上、下游引物各0.5μL和滅菌超純水4.4μL；

所述的PCR反應程序如下：

(1)利用引物P1的PCR反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性30s，52℃退火35s，72℃延伸35s，共進行35個循環，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

(2)利用引物P2的PCR反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性30s，58.1℃退火30s，72℃延伸30s，共進行35個循環，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測是用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和分析利用引物P1擴增的PCR產物，結果如下：純合型CC在185bp和336bp位的堿基是C，雜合型TC在185bp和336bp位的堿基是T/C，雜合型TT在185bp和336bp位的堿基是T；同樣用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和分析利用引物P2的PCR擴增產物，結果如下：純合型AA在127bp位的堿基是A，雜合型AG在127bp位的堿基是A/G，純合型GG在127bp位的堿基是GG。