[發(fā)明專利]白細(xì)胞介素-2基因整合表達(dá)載體的構(gòu)建及定位方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010199334.8
• 申請(qǐng)日: 2010-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN101921797A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹斌云;安小鵬;楊莎;王韻斐;侯金星;陳秋菊;崔易虹;王建剛;宋宇軒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/26;C12N15/63;C12Q1/68;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.白細(xì)胞介素-2基因整合表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：

1)以人靜脈血為試驗(yàn)材料，從血液中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，針對(duì)人白介素-2基因的編碼區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)含酶切位點(diǎn)的特異性引物P1，分別引入白介素-2基因的編碼區(qū)的ApaI酶切位點(diǎn)和SalI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得到目的片段，并克隆到pMD^TM19-T?Vector載體中；所述的特異性引物P1如下：

F：GGGCCCGCGATGTACAGGATGCAACTCC

R：ACGCGTCGACGCGTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT

2)以pBC1質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增β-酪蛋白5′同源短臂的含酶切位點(diǎn)的特異性引物P2，以及擴(kuò)增β-酪蛋白3′同源長臂的且含酶切位點(diǎn)的特異性引物P3，PCR擴(kuò)增β-酪蛋白5′同源短臂的調(diào)控序列和β-酪蛋白3′同源長臂；

所述的引物P2如下：

5′同源臂F：GGGGTACCTCAGGTCTAAGGTATCATCG

5′同源臂R：GGGCCCGAATAGGGAAGGGTCC

所述的引物P3如下：

3′同源臂F：TCCCCGCGGTGGACATTTGTTCTCTAT

3′同源臂R：CGAGCTCTGTATTGCAGGTGAAT

3)以pIRES質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增新霉素抗性基因表達(dá)盒的含酶切位點(diǎn)的特異性引物P4，PCR擴(kuò)增新霉素抗性篩選標(biāo)記基因序列；以pBluskm為載體骨架，分別與5′同源短臂的調(diào)控序列、3′同源長臂和新霉素抗性篩選標(biāo)記基因序列相連，構(gòu)建重組載體5′-3′-E-neo^r，雙酶切含IL-2基因的pMD^TM19-T?Vector載體，凝膠回收目的片段并與5′-3′-E-neo^r相連，得到IL-2基因整合表達(dá)載體5′-3′-E-neor-IL-2；

所述的引物P4如下：

Neo^r?F：ACGCGTCGACGGTATTTTCTCCTTACGC

Neo^r?R：CCATCGATATCGCTATCGATTCAC

所述的PCR擴(kuò)增的條件是：50μL反應(yīng)體系，包括2.5U?Taq?DNA聚合酶，8μL的2.5mM?dNTPmix，1.5μL的cDNA模板，5μL的10×LAPCR?Buffer(Mg²⁺)10pmol/μL的特異性引物的上、下游引物各1μL和滅菌超純水33μL；

PCR反應(yīng)程序如下：

(1)利用引物P1擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

(2)利用引物P2擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，62℃退火60s，72℃延伸150s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

(3)利用引物P3擴(kuò)增的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，58℃退火60s，72℃延伸150s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

(4)利用引物P4的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性60s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

2.權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-2基因整合表達(dá)載體的定位方法，其特征在于，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒5′-3′-E-neor-IL-2和pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后取出轉(zhuǎn)染了pIRES2-ZsGreen1質(zhì)粒的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)顯微鏡下10個(gè)視野的發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，其轉(zhuǎn)染效率15.66％；G418篩選陽性克隆，待細(xì)胞大量增值后，提取DNA，利用特異性引物P1，PCR擴(kuò)增出白細(xì)胞介素-2基因；

所述的特異性引物P1如下：

F：GGGCCCGCGATGTACAGGATGCAACTCC

R：ACGCGTCGACGCGTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。