[發明專利]達托霉素的純化方法

有效

• 申請號: 201010196247.7
• 申請日: 2010-06-09
• 公開（公告）號: CN102276696A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 夏興;蘇永槐;羅敏玉;孫新強;楊志均;李秋爽;戈梅;陳代杰;阮林高;楊天
• 申請（專利權）人: 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司;浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 繆利明

技術領域

本發明涉及藥物純化領域，具體涉及一種達托霉素的純化方法。

背景技術

由革蘭氏陽性耐藥菌引起感染的趨勢在不斷上升。雖然萬古霉素等糖肽類抗生素對這些耐藥病原菌，如耐甲氧西林金葡球菌、表皮葡萄球和腸球菌耐藥株等具有一定的治療效果，但近幾年來，隨著臨床上耐萬古霉素革蘭氏耐藥菌的出現，使得這種趨勢愈發增大，因此迫切需要尋找一類抗生素來對抗耐藥菌。

達托霉素是由玫瑰孢鏈霉菌產生的一種抗生素，如圖1所示，由十三個氨基酸組成，其中十個氨基酸組成一個氨基酸肽環，另有三個氨基酸排列成線狀，這三個氨基酸中末端的L-色氨酸接著一個十碳癸酸，是一種鈣離子依賴型的抗生素。在鈣離子存在的條件下，它將以非共價鍵的形式與細胞膜上達托霉素結合蛋白(DBPs)結合。達托霉素對于革蘭氏陽性菌具有很好的殺菌作用，可開發成制劑用于包括但不限于耐甲氧西林金黃色葡萄糖菌和耐萬古霉素腸球菌引起的感染。

中國發明專利申請(申請號01805212.6)和其分案申請(申請號200810087401.X)以及美國專利US6696412B1等公開了達托霉素的純化方法。利用陰離子樹脂FP-DA13從發酵液中富集達托霉素，接著利用反相樹脂HP-20ss進一步純化達托霉素，得到半純化的達托霉素。然后將半純化的達托霉素過Poros?P150或Poros?D50(Applied?Biosystem)純化，得到純度為98％的達托霉素。該方法提供了一種商業化可行的分離達托霉素的方法。但是，在該方法中使用到了的Poros?P150和Poros?D50兩種樹脂，由Applied?Biosystem公司生產，其價格非常昂貴，而且雖然分離效果較好，但由于其顆粒很細，在分離純化過程中需要很大壓力才能達到一定的流速。

發明內容

本發明的目的在于對中國發明專利申請(申請號01805212.6)和其分案申請(申請號200810087401.X)以及美國專利US6696412B1等公開的達托霉素的純化方法作進一步的改進，以降低成本，利于工業化推廣應用。

為此，本發明提供了一種達托霉素的純化方法，包括將半純化的達托霉素進一步純化的步驟，具體的，所述純化是指將所述半純化的達托霉素加載結合到凝膠型弱陰離子樹脂后進行洗脫。

本發明的達托霉素的純化方法，所述凝膠型弱陰離子樹脂為葡聚糖凝膠型弱陰離子樹脂，所述葡聚糖凝膠型弱陰離子樹脂為葡聚糖凝膠A25，所述葡聚糖凝膠A25在使用前采用含0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6～8。所述半純化的達托霉素加載結合到葡聚糖凝膠A25后進行洗脫，使用體積為柱體積3倍的含0-4mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用體積為柱體積10倍的含0.1-0.5mol/L氯化鈉、0-4mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進行洗脫，所述緩沖液的pH為6-8。

本發明的達托霉素的純化方法，所述凝膠型弱陰離子樹脂為瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹脂，所述瓊脂糖凝膠型弱陰離子樹脂為DEAE?fast?flow，所述DEAE?fastflow在使用前采用含0-6mol/L的尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液平衡，且所述緩沖液的pH為6～8。所述半純化的達托霉素加載結合到所述DEAE?fast?flow上進行分離純化，使用體積為柱體積3倍的含0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液洗滌后，采用含體積為柱體積5～10倍的含0.015-0.3mol/L氯化鈉、0-6mol/L尿素的醋酸緩沖液或Tris緩沖液進行洗脫，所述緩沖液的pH為6-8。

本發明的達托霉素的純化方法，所述半純化的達托霉素經步驟：A)、采用陰離子數脂從達托霉素發酵液中富集達托霉素粗溶液；B)、采用反向樹脂純化所述達托霉素粗溶液制得。

本發明的純化方法，使用的凝膠型樹脂，原料易得、相對廉價、易于工業化推廣應用。在緩沖液中添加尿素，破壞非共價鍵，有利于從樹脂上洗脫達托霉素。本發明的純化方法，得到的達托霉素的純度高于98％。

附圖說明

圖1為達托霉素結構圖。

圖2為純化后達托霉素的HPLC檢測圖譜。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限制本發明的范圍。

在本發明中，HPLC條件如下：

流動相：A相：乙睛∶緩沖液(10∶90)

B相：乙睛∶緩沖液(45∶55)