[發明專利]重組人表皮生長因子工程菌的構建方法

無效

• 申請號: 201010195640.4
• 申請日: 2010-06-09
• 公開（公告）號: CN101857865A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發明（設計）人: 于沖;夏海華
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及表皮生長因子工程菌的構建方法。

背景技術

人表皮生長因子(human?epidermal?growth?factor，hEGF)是由53個氨基酸組成的多肽，分子量約為6000Da。EGF(表皮生長因子)的生物學功能使其在制藥和化妝品領域具有廣泛的應用。EGF能刺激多種細胞生長，抑制胃酸分泌，因而可用于創傷和消化性潰瘍的治療，還能用于化妝品領域，具有護膚、抗皺、美白等作用，因此獲得大量具有生物活性的EGF尤為必要。hEGF曾在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和家蠶桿狀病毒中成功地表達。

重組人表皮生長因子應用方面尚有兩個亟需解決的問題，即重組人表皮生長因子的產量和生物活性問題。目前，臨床應用的hEGF產品有的是細胞內以融合蛋白形式表達，鑒于hEGF在胞內以包涵體形式存在，在分離中需破裂細胞，導致純化困難、產量低；而另外一些產品雖然是分泌性表達目的蛋白，提高了產量，但其導入的信號肽為堿性磷酸酶，只能穿過細胞內膜分泌到細胞周質中，存在分離中需破裂細胞，而且生物活性降低。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有重組人表皮生長因子的純化困難、產量低和生物活性低問題，而提供重組人表皮生長因子工程菌的構建方法。

重組人表皮生長因子工程菌的構建方法按以下步驟進行：一、根據大腸桿菌偏愛密碼子設計重組hEGF人工序列，然后合成重組OmpA-hEGF人工序列，再將重組OmpA-hEGF人工序列連接到質粒pMD上，合成出質粒pMD-OmpA-hEGF；二、質粒pMD-OmpA-hEGF和質粒pSE分別經XhoI和EcorI進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建質粒pSE-OmpA-hEGF；三、將質粒pSE-OmpA-hEGF轉化到大腸桿菌BL21-Codon?plus^TM中，即完成重組人表皮生長因子工程菌的構建；其中步驟一中根據大腸桿菌偏愛密碼子設重組hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。

本發明中以BL21-Codon?plus^TM為宿主菌，選用分泌性表達載體pSE系列作為hEGF表達載體，同時導入信號肽OmpA序列，能同時穿過細胞內膜及外膜，使其表達為細胞外分泌性，避免了胞內以包涵體形式表達時所造成的純化困難的弊端，且該系列載體C端含有6×His基因，所表達蛋白可利用商品化親和層析柱快速純化，蛋白的純度高和生物活性高。

本發明中原核表達系統的遺傳背景清楚，易于改造，工藝簡單，成本低，流程短，產量高達50mg/L，獲得的蛋白易于純化，是表達外源基因的首選系統。

具體實施方式

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式重組人表皮生長因子工程菌的構建方法按以下步驟進行：一、根據大腸桿菌偏愛密碼子設計重組hEGF人工序列，然后合成重組OmpA-hEGF人工序列，再將重組OmpA-hEGF人工序列連接到質粒pMD上，合成出質粒pMD-OmpA-hEGF；二、質粒pMD-OmpA-hEGF和質粒pSE分別經XhoI和EcorI進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建質粒pSE-OmpA-hEGF；三、將質粒pSE-OmpA-hEGF轉化到大腸桿菌BL21-Codonplus^TM中，即完成重組人表皮生長因子工程菌的構建；其中步驟一中根據大腸桿菌偏愛密碼子設計重組hEGF人工序列的基因序列如下：CCCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGGTCACGGTACTGGCAACGTTCACCGATGTAACCAACAACACAGTTGCACGCGTATTTGTCCAGAGCTTCGATATACATGCAAACACCATCGTGTAGGCAGTAACCGTCGTGAGACAGCGGGCATTCAGAGTCGGAATTGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCAATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATGAATTCCG。